李夢(mèng)尋 ，胡九英 ，謝蘇 ，邱梅玉 ，魯慧文 ，公紅斌 ，來(lái)紅霞 ，黃濤

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2新疆正大食品有限公司,新疆 五家渠 831301）

豬繁殖力是影響?zhàn)B豬企業(yè)生產(chǎn)效益的重要經(jīng)濟(jì)性狀，但其遺傳力低并受多種效應(yīng)的影響，這使得利用常規(guī)育種對(duì)該性狀進(jìn)行遺傳改良進(jìn)展緩慢。因此，利用影響產(chǎn)仔性能的主效基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種是加快母豬繁殖性狀遺傳進(jìn)展的有效途徑。

FSHβ是母豬繁殖性狀的主效基因，其β亞基使FSH具有生物活性并具有一定特異性，F(xiàn)SHβ由卵泡刺激素β亞基的基因編碼。FSH能誘導(dǎo)雌性動(dòng)物的卵泡發(fā)育，促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)等，F(xiàn)SH還協(xié)同LH一起刺激性腺類(lèi)固醇、雌二醇和孕酮的合成和分泌[1]。FSH在畜牧業(yè)生產(chǎn)中用于家畜的同期發(fā)情和超數(shù)排卵等[2]。有研究認(rèn)為FSHβ基因可作為遺傳學(xué)中有關(guān)繁殖性狀研究的重要分子標(biāo)記，基因中的1處逆轉(zhuǎn)座子插入突變產(chǎn)生 AA、AB、BB三種基因型[3]。趙要風(fēng)等[4]研究報(bào)道，F(xiàn)SHβ的 AA 基因型可顯著提高產(chǎn)仔數(shù)。ITGB1是整合素家族成員，整合素β1在子宮內(nèi)膜中表達(dá)水平的變化，可能會(huì)影響子宮內(nèi)膜對(duì)胚泡的識(shí)別、粘附，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性的降低，從而使胚胎著床失敗[5]。目前對(duì)于ITGB1對(duì)繁殖性狀的影響的研究報(bào)道較少，但可根據(jù)ITGB1對(duì)胚胎附植方面的影響，將ITGB1基因作為影響母豬繁殖性能的候選基因，其是否對(duì)母豬繁殖性狀有影響還需要進(jìn)行試驗(yàn)證實(shí)。

本研究檢測(cè)了939頭大白豬FSHβ和ITGB1基因多態(tài)性并分析其前三胎次單個(gè)基因基因型和合并基因型與豬繁殖性狀之間的關(guān)系，以期為大白豬分子標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)所選用的939頭大白母豬均來(lái)自新疆正大種豬場(chǎng)。采集耳組織樣本，放入含1 mL 75%酒精的Eppendoff管內(nèi)，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存，以備后面的樣本組織DNA提取。此外搜集整理了樣本群體經(jīng)產(chǎn)頭胎（939窩）、二胎（909窩）和三胎（775窩）的總仔數(shù)、活仔數(shù)、健仔數(shù)、窩重、死胎、木乃伊等繁殖性狀相關(guān)資料。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

2×EsTaqMasterMix購(gòu)自 CWBIO 公司；Marker DL2000、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA抽提試劑盒，購(gòu)自TIANGEN公司；限制性內(nèi)切酶RasI購(gòu)自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

FSHβ和ITGB1基因PCR擴(kuò)增引物參照和Knoll等[6]和劉超等[7]的引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)引物Tab.1 Primers in the study

1.2.2 豬耳組織DNA提取

用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA抽提試劑盒對(duì)所采集母豬耳組織樣進(jìn)行基因組DNA提取并檢測(cè)其濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增與多態(tài)性檢測(cè)

1.2.3.1 PCR擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系 15 μL：2×Es Taq Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各 0.4 μL，模板 DNA 0.5 μL，去離子水 6.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃，4 min，35循環(huán) (94 ℃，30 s；56 ℃/60 ℃，30 s；72 ℃，30 s)，72℃延伸5min。所有基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)后進(jìn)行下一步反應(yīng)。

1.2.3.2 基因型檢測(cè)

FSHβ基因由片段插入造成，2.0%瓊脂糖電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物即可見(jiàn)多態(tài)性。ITGB1基因酶切反應(yīng) ：4 μL PCR 產(chǎn) 物 、0.4 μL RsaI、1.0 μL Buffer及雙蒸水 4.6 μL，37 ℃條件下酶切 2.5 h；反應(yīng)結(jié)束后取酶切產(chǎn)物10 μL用5.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分型。

1.2.4 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

用Excel表格計(jì)算基因、基因型頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)、群體雜合度(H)，并對(duì)基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，用SPSS17.0分析總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、健仔數(shù)等繁殖性狀在不同基因型之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及酶切結(jié)果

FSHβ基因由片段插入造成，瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物即可見(jiàn)多態(tài)性，PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)生3種帶型(圖1)：500 bp純合子 (AA基因型)，500、220 bp雜合子 (AB基因型)，220 bp純合子(BB基因型)。

圖1 FSHβ基因的酶切結(jié)果Fig.1 The results of enzyme digestion of FSH beta gene

ITGB1基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶Rsa I酶切電泳檢測(cè)到3種帶型 (圖2)：22和114 bp的片段為CC基因型，22、114和136 bp為 CT基因型，136 bp的片段為T(mén)T基因型。由于22 bp片段較小，因此在圖像中未有顯示。

圖2 ITGB1基因基因的酶切結(jié)果Fig.2 The results of enzyme digestion of ITGB1 gene

2.2 各基因型頻率、基因頻率及群體遺傳特性

2.2.1 各基因型頻率、基因頻率

由表2可知，F(xiàn)SHβ基因型頻率在大白豬上為BB>AB>AA，優(yōu)勢(shì)基因?yàn)锽等位基因。ITGB1基因型頻率在大白豬上為CT>CC>TT，優(yōu)勢(shì)基因?yàn)镃基因。

表2 FSHβ和ITGB1基因的基因型頻率及等位基因頻率Tab.2 The frequencies of genotype and allele of FSHβand ITGB1 genes

2.2.2 不同基因的群體遺傳特性

由表3可知，F(xiàn)SHβ和ITGB1基因在試驗(yàn)群體中具有中度多態(tài)（0.25

表 3 基因PIC、H、Ne及 χ2檢驗(yàn)Tab.3 Date ofPIC，H，Neand χ2test of FSHβ and ITGBI genes

2.3 基因多態(tài)性與豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 單個(gè)基因多態(tài)性與豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

FSHβ基因在頭胎的死胎數(shù)性狀上AB基因型顯著低于BB型0.15頭/胎(P<0.05)，而在窩重性狀上AB基因型顯著高于BB基因型0.69 kg/胎(P<0.05)，其他胎次中不同基因型對(duì)繁殖性狀的影響不顯著（表4）。ITGB1基因在頭胎的總仔、健仔和窩重性狀上均為CC>CT>TT，但在死胎數(shù)上TT型顯著低于CC型(P<0.05)；在二胎的窩重性狀上CC型顯著高于CT和TT型，分別高0.88 kg/胎和0.97 kg/胎(P<0.05)；在三胎健仔數(shù)和窩重性狀中CC型均顯著高于CT型 (P<0.05)，由此可見(jiàn)CC基因型為ITGB1在繁殖性狀上的優(yōu)勢(shì)基因型（表4）。

表4 FSHβ與ITGB1基因多態(tài)性與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.4 Correlation analysis of FSHβ and ITGB1 gen polymorphism and sow reproduction traits

2.3.2 合并基因型與豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.3.2.1 FSHβ與ITG B1合并基因型與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表5可見(jiàn)，在初產(chǎn)繁殖情況中，F(xiàn)SHβ 與ITGB1合并基因型中AATT在各繁殖性狀中優(yōu)于其他基因型，但其個(gè)體數(shù)量較少。在初產(chǎn)總產(chǎn)仔數(shù)性狀上，BBCC型個(gè)體比 ABTT型高出 1.25頭 /胎（P<0.05），在健仔數(shù)性狀上ABCC顯著高于ABTT和BBCT（P<0.05），在死胎性狀上 ABCT、ABTT 極顯著低于BBCC（P<0.01），在窩重性狀上 ABCC顯著高于BBCT 1.46 kg。二胎次中，在總產(chǎn)仔數(shù)性狀上BBCC基因型顯著高于BBCT基因型（0.80頭/胎）和BBTT基因型（0.85頭/胎），在總活仔數(shù)上BBCC基因型顯著高于AACC型1.17頭/胎(P<0.05)，在健仔數(shù)上BBCC基因型顯著高于AACC型0.97頭/胎(P<0.05)，但其死胎數(shù)多于其他基因型(P<0.05)。

表5 FSHβ和ITGB1合并基因型與大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.5 Correlation analysis of the combined genotypes of FSHβ and ITGB1 in Yorkshire reproduction traits

表5 續(xù)

由表5可見(jiàn)，三胎次中，在窩重性狀中三胎次中ABCC顯著高于BBCT與BBTT型，在總產(chǎn)仔數(shù)和總活仔性狀中BBCC基因型顯著高于BBCT型0.85頭/胎(P<0.05)和0.68頭/胎(P<0.05)。由此可見(jiàn)，在初產(chǎn)繁殖性狀中的優(yōu)勢(shì)基因型AATT，BBCC次之；在經(jīng)產(chǎn)二胎次和三胎次中，BBCC為優(yōu)勢(shì)基因型。因此，可以選留較少數(shù)的高產(chǎn)AATT型個(gè)體以及BBCC型個(gè)體分別進(jìn)行純繁，以提升大白母豬群體繁殖性能。

3 討論

FSHβ是母豬繁殖性狀的一個(gè)主效基因。研究表明B等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因，經(jīng)產(chǎn)母豬各基因型之間產(chǎn)仔數(shù)差異不顯著[8]。在趙要風(fēng)等[3]的研究中，杜洛克、大約克、長(zhǎng)白等國(guó)外豬種中BB型為FSHβ的優(yōu)良基因型，AA型比較罕見(jiàn)，而Korwin-Kossakowska等[9]、Linville等[10]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ對(duì)產(chǎn)仔數(shù)的提高無(wú)顯著影響。本研究所用經(jīng)產(chǎn)大白豬群體，F(xiàn)SHβ基因型頻率為AB>BB>AA，優(yōu)勢(shì)基因?yàn)锽等位基因，在初產(chǎn)胎次中，死胎數(shù)性狀上AB基因型顯著低于BB型(P<0.05)，而在窩重性狀上AB基因型顯著高于BB基因型(P<0.05)，這與前人的研究有所不同。在經(jīng)產(chǎn)胎次FSHβ的不同基因型對(duì)經(jīng)產(chǎn)母豬不同繁殖性狀的影響均不顯著，這與前人[11-13]的結(jié)論一致。這表明單個(gè)基因FSHβ對(duì)經(jīng)產(chǎn)母豬的繁殖性狀的選擇可能不具有顯著意義。

目前對(duì)于ITGB1基因的研究大多集中在ITGB1基因?qū)θ寺殉舶┘?xì)胞黏附和侵襲能力的影響研究較多[14]。郭良勇等[15-16]分別采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)技術(shù)和DNA池測(cè)序技術(shù)對(duì)ITGB1基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明等位基因T的頻率為0.55；ITGB1基因型效應(yīng)顯著影響（P＜0.05）母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀，3種基因個(gè)體TNB和 NBA的總體趨勢(shì)為 TT＞TC＞CC。翟騰蛟等[17]在269頭大白豬中做了ITGB1基因的多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)各基因型對(duì)母豬產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔和健仔數(shù)影響的趨勢(shì)也是 TT＞TC＞CC，而沈永巧等[18]在檢測(cè)了685頭母豬ITGB1的基因的多態(tài)性時(shí)分析發(fā)現(xiàn)各基因型對(duì)母豬總產(chǎn)仔數(shù)性狀的影響趨勢(shì)為T(mén)C>CC>TT。本研究中檢測(cè)了大白豬頭胎939窩，二胎次909窩，三胎次775窩，并分別作了基因型與產(chǎn)仔性狀關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果ITGB1基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)影響的趨勢(shì)CC>TT、CC>TC差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05），與其他人的研究結(jié)果均不一致。這種差異可能是由對(duì)母豬的飼養(yǎng)管理、胎次以及檢測(cè)數(shù)量的不同而造成的。

FSHβ-ITGB1不同合并基因型在在大白豬的總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、窩重、死胎性狀上均存在不同的差異。本研究通過(guò)對(duì)較大群體的大白豬重進(jìn)行分FSHβ-ITGB1合并基因型檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)：在二胎次和三胎次中BBCC為最優(yōu)分子標(biāo)記組合，AATT次之，因此可通過(guò)提高 BBCC基因型頻率來(lái)提高豬群的繁殖效益。這提示在種豬繁殖性狀的選育過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)豬群特征有目的地選擇2個(gè)或多個(gè)影響繁殖性能的候選基因進(jìn)行合并，并結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種方法來(lái)進(jìn)一步有效地改善母豬的繁殖性狀。

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