，，，

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori，HP)對抗生素的耐藥性是導致根除治療失敗的重要原因，藥敏實驗為判定HP是否具有抗藥性的金標準方法。異質(zhì)性耐藥(heteroresistance)，是指同一患者體內(nèi)同時存在對某種抗生素敏感和耐藥的菌株。異質(zhì)性耐藥的原因可能是最初的混合感染，也可能是菌株在宿主體內(nèi)的長期感染過程中基因突變造的多種突變體[1]，HP感染的相關(guān)特征尤為突出，因為HP一旦感染，不經(jīng)規(guī)范根除治療，慢性感染往往會持續(xù)多年。克拉霉素是HP根除療法的一線藥物，HP克拉霉素耐藥問題已于2017年被世界衛(wèi)生組織列為全球耐藥問題高度優(yōu)先級[2]。臨床HP藥敏試驗通常選取數(shù)個分離培養(yǎng)單菌落，很難充分反映HP的異質(zhì)性耐藥情況。目前，國外關(guān)于HP對甲硝唑[3]，克拉霉素[4]，阿莫西林[5-6]的異質(zhì)性耐藥均有報道，中國人群感染的HP具有甲硝唑和克拉霉素高耐藥特征，但對其異質(zhì)性耐藥的報道較少。Kao等[7]報道臺灣存在左氧氟沙星、克拉霉素和甲硝唑的異質(zhì)性耐藥，Wong等[8]報道了香港的甲硝唑異質(zhì)性耐藥，但均缺乏對相關(guān)特征的深入分析。

多位點序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)是對微生物的管家基因序列進行比對分析的常用分型方法。本研究通過對6個克拉霉素異質(zhì)性耐藥樣本來源的81個HP克隆進行MLST分析，以期對HP的異質(zhì)性耐藥特征進行分析。

1 材料與方法

1.1分離培養(yǎng)及抗生素耐藥檢測 選用特制的黏液刷于胃鏡下刷取某醫(yī)院50例13C呼氣試驗陽性患者的胃竇黏液樣本，進行HP分離培養(yǎng) (Karmali培養(yǎng)基：OXOID公司，脫纖維羊血：北京蘭博瑞生物制品有限公司)，分離培養(yǎng)陽性者44例，對每個培養(yǎng)陽性樣本挑選16個HP克隆(不足16個克隆者挑取所有HP克隆)，用Etest法測定每個克隆的克拉霉素最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。依照CLSI的標準，將克拉霉素MIC≥1 mg/L的HP判定為耐藥克隆。最終得到全敏感克隆相關(guān)病例24例，異質(zhì)性耐藥病例11例，全耐藥克隆相關(guān)病例9例。從11例異質(zhì)性耐藥患者中選取6例MIC值差異較大的標本(編號1，2，3，4，5，6)，共81個HP克隆，進行進一步的進化特征分析。

1.2 基于MLST的進化特征分析

1.2.1核酸提取 每個克隆進行擴大培養(yǎng)，并用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒(QIAGEN公司，德國)進行基因組的提取。

1.2.2PCR擴增測序 選取MLST官網(wǎng)推薦的8個管家基因(atpA,efp,mutY,ppa,trpC,ureI,vacA,yphC)，引物序列參考http://pubmlst.org/helicobacter，見表1，對PCR擴增產(chǎn)物進行純化并測序。引物合成由上海生工生物工程有限公司進行，擴增產(chǎn)物的純化及測序由北京天一輝遠生物科技有限公司進行。

表1 PCR擴增和測序引物
Tab.1 Primers used in PCR amplification and sequencing

基因引物序列(5′?3′)長度/bpatpAatpA＿FGGACTAGCGTTAAACGCACG626?627atpA＿RCTTGAAACCGACAAGCCCACefpefp＿FGGCAATTTGGAT?GAGCGAGCTC410efp＿RCTTCACCTTTTCAAGATACTCmutYmutY＿FGTGGTTGTAGYTGGAAACTT?TACAC419?420mutY＿RCTTAAGCGTGTGTYTTTCTAGGppappa＿FGGAGATTGCAATGAATTTAGA398ppa＿RGTGGGGTTAARATCGTTAAAT?TGtrpCtrpC＿FTAGAATGCAAAAAAG?CATCGCCCTC456trpC＿RTAAGCCCGCACACTT?TATTTTCGCCureIureI＿FAGGTTATTCGTAAGGTGCG585ureI＿RGTTTAAATCCCTTAGATTGCCvacAvacA＿FACAACCGTGATCATTCCAGC364?445vacA＿RATACGCTCCCACGTATTGCyphCyphC＿FCACGCCTATTTTTTTGACTA?AAAAC504?531yphC＿RCATTYACCCTCCCAATGATGC

1.2.3MLST分析 將81個HP克隆的8個管家基因進行序列分析，用MEGA 7.0軟件中的clusterW程序?qū)λ行蛄羞M行多序列比對，并與MLST數(shù)據(jù)庫中的已有等位基因進行比對，將新的等位基因序列提交，以獲得已有或新發(fā)現(xiàn)的等位基因序列號；提交新的等位基因譜(7個管家基因：atpA,efp,mutY,ppa,trpC,ureI,yphC)，以獲得已有或新發(fā)現(xiàn)的ST型別。

1.2.4菌株進化關(guān)系分析 將每個克隆的8個管家基因的核心序列串聯(lián)成1個3 850 bp的序列，用MEGA 7.0軟件中的clusterW程序?qū)Υ?lián)序列進行比對和分析，采用Bootstrap的1 000次重復，進化距離用最大似然法(Maximum Composite Likelihood method)計算，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)生樹[9-12]。

2 結(jié) 果

2.1異質(zhì)性耐藥情況 44個分離培養(yǎng)成功的樣本中，有20(46.51%)個克拉霉素耐藥，耐藥樣本中有11(55.00%)例為異質(zhì)性耐藥，異質(zhì)性耐藥占全部分離培養(yǎng)陽性樣本的25.58%。對6個異質(zhì)性耐藥樣本分離所得的81個克隆對克拉霉素的MIC值，見圖1。6個樣本中耐藥克隆所占比例為21.43%～90.91%(平均值62.00%，中位數(shù)75.00%)。6個樣本內(nèi)部MIC值差異很大。

圖1 6個異質(zhì)性耐藥樣本中的81個HP克隆對克拉霉素的MIC值Fig.1 Clarithromycin MIC values of all 81 isolates in 6 heteroresistant samples

2.2MLST分析結(jié)果 對81個HP克隆的8個管家基因的核酸片段進行擴增、測序，得到的序列剪切后上傳至MLST數(shù)據(jù)庫，共獲得17個ST型別，均為新發(fā)現(xiàn)的ST型。每個病例的9～16個分離株被分為1～6種不同的ST型，各分離株間vacA基因的差異又將其分為不同的基因型，見表2。

表2 81個HP克隆的ST型別，vacA基因型及對應克隆耐藥情況
Tab.2 ST type, vacA genotype and clarithromycin susceptibility of all 81 isolates

樣本ST型別vacA基因型分離株132067271?2，1?4，1?5，1?6，1?7，1?8，1?9，1?10，1?11，1?12，1?13，1?14，1?15，1?1632066611?1，1?3232077342?1，2?2，2?4，2?7，2?10，2?14，2?15，2?1632087342?3332097433?1，3?3，3?4，3?6，3?7，3?9，3?12，3?14，3?1632107433?232117433?5，3?8，3?11，3?13，3?15432127584?2，4?3，4?4，4?6，4?7，4?8，4?9，4?10，4?13，4?1432127594?11532137695?1，5?3，5?7，5?1032137735?4，5?13，5?15，5?1632137745?1432147695?2，5?932157695?5，5?632647695?832167695?1132177695?12632187856?2，6?832197856?3，6?4，6?5，6?10，6?1532207856?6，6?7，6?9，6?11，6?13，6?1632217856?14

注：克隆編號以下劃線表示耐藥克隆

對81個HP克隆構(gòu)建進化樹，見圖2。1號樣本的2個敏感克隆和14個耐藥克隆同屬ST3206型，但耐藥克隆相比敏感克隆，vacA基因有2個堿基缺失，遺傳距離為17.97%；2號樣本的2個ST型別間有5個堿基差異，均位于yphC基因，遺傳距離為0.13%；3號樣本的3個ST型別間僅有1個堿基差異，遺傳距離為0.03%～0.05%；4號樣本的所有克隆同屬1個ST型，但vacA基因有1個堿基差異，遺傳距離為0.03%；5號樣本的6個ST型各克隆間共有149個堿基差異，分布在7個等位基因(atpA,efp,mutY,ppa,ureI,yphC,vacA)中，兩兩組間遺傳距離為0.03%～3.84%，eBURST分析將其分為2組，3213，3216，3264為1組，3215，2314，3217為1組；6號樣本的4個ST型，atpA，mutY，ureI等位基因間分別相差10，13，7個堿基，組間遺傳距離為0.18%～0.78%?？梢妬碓从?號標本的克隆明顯來源于至少2個型克隆，其他5例病人體內(nèi)的HP在進化樹中分別獨立聚為單一克隆群，6份標本中的克隆在聚類中沒有發(fā)現(xiàn)標本中的交叉。

注：標尺單位為每個位點的堿基替換率圖2 全部81個HP克隆的MLST系統(tǒng)進化分析Fig.2 Evolutionary relationships of 81 isolates

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)HP克拉霉素異質(zhì)性耐藥占全部分離培養(yǎng)陽性樣本的25.58%，占耐藥樣本的55.00%，這種高異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象應引起高度重視；其中耐藥性克隆比例較低的異質(zhì)性耐藥樣本，常規(guī)耐藥性檢測有較高的檢測假陰性可能。

應用MLST方法對菌株進行遺傳相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)對6例異質(zhì)性耐藥患者的樣本分離所得克隆，在5例中分別聚成單獨的克隆群。推測在患者感染HP過程中引起異質(zhì)性耐藥的原因分為兩類：一類是由于胃內(nèi)的HP在長期感染的過程中一次或多次接觸抗生素壓力[13]，因此盡管MIC值差異很大，克隆間遺傳距離很近；另一類可能與不同HP菌株的混合感染相關(guān)[14]。

異質(zhì)性耐藥是對現(xiàn)有耐藥檢測方法的一大挑戰(zhàn)，本研究提示來自中國人群的HP感染菌株存在明顯的克拉霉素異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，進行傳統(tǒng)藥敏試驗中對少數(shù)培養(yǎng)菌落的檢測方式在某些病例可能不足以反映克拉霉素耐藥的真實情況；如何改進HP克拉霉素耐藥檢測評價方法并指導臨床HP感染的精準治療，應引起高度重視。

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