曹 師,史 敏,李彥忠,2

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

紅豆草(Onobrychisviciaefolia)是豆科(Leguminosae)紅豆草屬多年生牧草，是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的豆科牧草，飼草和種子都含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。有“牧草皇后”之稱[2]的紅豆草其飼用價(jià)值可與“牧草之王”紫花苜蓿(Medicagosativa)相媲美。然而病害是紅豆草生長(zhǎng)和生產(chǎn)的重要限制因素，植株染病后可嚴(yán)重影響種子質(zhì)量和植株的生物量[3-4]。在我國(guó)由紅豆草殼二孢(Ascochytaonobrychidis)引起的葉斑與黑莖病是紅豆草生最為常見的一種病害，主要分布在內(nèi)蒙古、甘肅和新疆等地[5]；同時(shí)該病在國(guó)外也分布廣泛，主要分布在歐洲，不同的是在國(guó)外紅豆草上的殼二孢被報(bào)道為蠶豆殼二孢(A.fabae)[6]和歪頭菜殼二孢(A.orobi)[7]。 該病原寄主范圍廣，侵染力強(qiáng)，植株的葉、莖和莢果均可被侵染[8]，以莖葉部為主，葉部病斑多出現(xiàn)于葉片中間或側(cè)緣，病斑近圓形，邊緣深褐色；在葉柄和莖稈上病斑梭形、橢圓形或不規(guī)則的大斑，邊緣黑色，發(fā)生嚴(yán)重的植株，病變部相連使葉柄和莖稈大部分表面變黑，植株受害后，嚴(yán)重影響紅豆草的生產(chǎn)。

生產(chǎn)上防治紅豆草殼二孢葉斑與黑莖病主要依賴于抗病品種的選育和化學(xué)殺菌劑拌種等手段[5,8]。這些措施均有各自的弊端，抗病品種的選育周期長(zhǎng)、成本高；長(zhǎng)期使用化學(xué)試劑一方面容易產(chǎn)生耐藥性菌株，另一方面對(duì)環(huán)境造成污染，破壞生態(tài)系統(tǒng)，威脅人畜安全[9]。近年來(lái)生物防治的高效、無(wú)毒無(wú)害、無(wú)污染、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)不僅保證了生態(tài)安全，而且為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了保障，因此生物防治也越來(lái)越受到重視。Wakelin等[10]從土壤分離得到的細(xì)菌芽孢桿菌(Bacillus)在室內(nèi)和田間均對(duì)豌豆根腐絲囊霉(Aphanomyceseuteiches)有很強(qiáng)的抑菌效果；Wharton等[11]用分離得到的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)菌液處理馬鈴薯(Solanumtuberosum)種子后，能夠顯著降低馬鈴薯晚疫病的發(fā)病率；Gopalakrishnan等[12]分離得到的5株放線菌菌株在溫室和田間條件下均對(duì)鐮刀菌起到良好的抑制效果。為探索紅豆草殼二孢葉斑和黑莖病的生物防治途徑，本研究以從紅豆草莖部分離得到的拮抗放線菌株為材料，以紅豆草殼二孢為指示病原，通過(guò)形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、生理生化特性以及16S rDNA基因序列分析對(duì)該拮抗菌株進(jìn)行分類地位的確定和拮抗作用的初探，旨在為紅豆草殼二孢葉斑與黑莖病的生物防治研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：放線菌LYZ0255分離自紅豆草莖部；紅豆草殼二孢葉斑病致病菌Ascochytaonobrychidis分離于甘肅地區(qū)栽培紅豆草染病植株。

培養(yǎng)基：放線菌菌株的活化和培養(yǎng)采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基；放線菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基參照范麗霞[13]篩選的小米培養(yǎng)基1 000 mL：小米1%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.25%，CaCO30.1%，(NH4)2SO40.1%，紅豆草殼二孢葉斑病菌的分離和培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dexterous agar medium,PDA)培養(yǎng)基。

1.2 菌種鑒定

1.2.1形態(tài)學(xué)觀察 依照閻遜初[14]的方法，將拮抗放線菌劃線接種在高氏一號(hào)培養(yǎng)基，采用插片培養(yǎng)法，在接種點(diǎn)斜45 ℃插入滅菌的蓋玻片，28 ℃培養(yǎng)1周后取出蓋玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

用革蘭氏染色觀察：挑取少許待測(cè)菌株置于滴有蒸餾水的載玻片上涂片，通過(guò)火焰3次固定。加結(jié)晶紫染色1 min，水洗；加碘液染色1 min，水洗；加95%的酒精，脫色30～60 s，水洗，吸干水分；加番紅復(fù)染1 min，水洗。吸干或在空氣中晾干后，用油鏡鏡檢，觀察菌株形態(tài)特征[15]。

1.2.2培養(yǎng)特征和生理生化特性研究 將待鑒定菌株分別接種在高氏一號(hào)、克氏一號(hào)、察氏瓊脂、葡萄糖天門冬素瓊脂、葡萄糖酵母膏瓊脂、淀粉瓊脂等培養(yǎng)基和馬鈴薯塊上[16]，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在7、14和28 d觀察并記錄氣生菌絲、基內(nèi)菌絲和可溶性色素的顏色變化。取穩(wěn)定期的顏色特征為期培養(yǎng)特征和定種依據(jù)。生理生化特性研究：參照周德慶[17]和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》中所描述的方法，采用明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、纖維素水解、硫化氫的產(chǎn)生和碳源利用試驗(yàn)進(jìn)行待測(cè)菌株的生理生化特性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)中所描述標(biāo)準(zhǔn)菌株的生理生化特性進(jìn)行比對(duì)[16,18]。

1.2.316S rDNA序列擴(kuò)增與分析 待測(cè)菌株基因組的提取采用OMEGA Bacterial DNA Kit試劑盒，按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作。16S rDNA序列擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物1429R(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和27F(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成[19]。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增采用20 μL的反應(yīng)體系，包括ddH2O 8.5 μL，Taq酶 10 μL，引物1429R和27F各0.5 μL，DNA模板0.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得序列在EzBioCloud的EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，下載與待測(cè)菌株序列同源性相近的模式菌株序列，利用MEGA6.0軟件采用Neighbor-Joining(N-J)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.3 抑菌效果測(cè)定

1.3.1平板對(duì)峙試驗(yàn) 用直徑5 mm的打孔器將紅豆草殼二孢病原菌塊接種于PDA培養(yǎng)皿中心，同時(shí)用滅菌的接種針挑取單菌落放線菌接種于距病原菌3 cm處，每皿點(diǎn)接4個(gè)供試菌株，各點(diǎn)位置成十字形[21]；以只接種紅豆草殼二孢菌塊的處理為對(duì)照，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，22 ℃下培養(yǎng)，待對(duì)照長(zhǎng)滿全皿時(shí)，記錄菌落直徑，按照如下公式計(jì)算相對(duì)抑制率。

相對(duì)抑制率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100% 。

1.3.2放線菌LYZ0255無(wú)菌發(fā)酵液的制備 在裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中轉(zhuǎn)接兩個(gè)放線菌菌餅(直徑5 mm，活化4 d)，在28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)4 d。將帶菌發(fā)酵液在無(wú)菌環(huán)境下取適量裝入滅菌的50 mL離心管中，在4 ℃、8 000 r·min-1下離心15 min，去沉淀，上清液用0.22 μm細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，即得含放線菌菌株的無(wú)菌發(fā)酵液(Actinomyces sterile fermentation broth,A-SFB )；同樣條件下未接種放線菌的液體培養(yǎng)基制成不含放線菌的無(wú)菌發(fā)酵液(sterile fermentation broth,SFB)，得到兩種無(wú)菌發(fā)酵濾液保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.3LYZ0255無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用測(cè)定 分別取1 mL備用的A-SFB、SFB和無(wú)菌水與9 mL無(wú)菌PDA混勻，制成含有A-SFB、SFB和無(wú)菌水的平板培養(yǎng)基(無(wú)菌水平板作為對(duì)照)，用直徑5 mm的打餅器取生長(zhǎng)狀況一致的紅豆草殼二孢菌餅轉(zhuǎn)移至各培養(yǎng)基中央，在22 ℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，待對(duì)照長(zhǎng)滿全皿時(shí)，記錄菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，方法同1.3.1。

1.3.4LYZ0255無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病菌孢子萌發(fā)抑制作用測(cè)定 采用凹片法，分別吸取100 μL的A-SFB、SFB和無(wú)菌水加入到凹形載玻片中的凹槽中，再吸取等量的濃度為1×106個(gè)·mL-1紅豆草殼二孢孢子懸浮液加入到上述凹玻片的凹槽中，將混合的凹載玻片放入到有雙層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，在恒溫培養(yǎng)箱中22 ℃培養(yǎng)，12 h后檢查孢子萌發(fā)情況，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)顯微鏡下觀察5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率[22]。

孢子萌發(fā)抑制率=[(對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率)/對(duì)照萌發(fā)率]×100% 。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

2.1.1菌落和形態(tài)特征 在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫條件下該手拮抗菌生長(zhǎng)良好，菌落黃白色(圖1A)；基內(nèi)菌絲無(wú)色，無(wú)隔不斷裂；氣生菌絲蛛網(wǎng)灰色，呈樹杈狀分支(圖1B)；孢子絲鉤狀，頂端螺旋形(圖1C)，孢子圓形或卵圓形。

拮抗菌株在大多數(shù)培養(yǎng)基上可產(chǎn)生可溶性色素，顏色呈黃白色、琥珀色或微黃白色，僅在察氏瓊脂培養(yǎng)基上無(wú)可溶性色素產(chǎn)生；氣生菌絲多為灰白色和白色，在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上呈黃色；基內(nèi)菌絲灰色、褐色、灰褐色或橙黃色，同時(shí)該菌株在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度存在差異(表1)。

2.1.2生理生化特征 參照鏈霉菌鑒定手冊(cè)中放線菌分類所記載的生理生化試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，該菌株明膠液化反應(yīng)呈陽(yáng)性，且明膠液化速度快(圖2A)；牛奶凝固與胨化反應(yīng)呈陽(yáng)性(圖2B)；淀粉水解反應(yīng)，菌落周圍遇碘不變色形成透明圈，但透明圈直徑小(圖2C)，表明該菌株可產(chǎn)生淀粉酶但活性不強(qiáng)；纖維素水解試驗(yàn)結(jié)果為弱陽(yáng)性，菌株在纖維素上有一些生長(zhǎng)(圖2D)；該菌株在柴斯納(Tresner)瓊脂培養(yǎng)基上沒有黑色素產(chǎn)生，不產(chǎn)生H2S；該菌株能夠利用葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖、木糖和甘露醇作為碳源，不能利用鼠李糖和肌醇。該結(jié)果與《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[15]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8版)[17]中有關(guān)微白黃鏈霉菌Streptomycesalbidoflavus所描述的生理生化特征基本相同，因此，初步認(rèn)為菌株LYZ0255為S.albidoflavus。

圖1 放線菌LYZ0255菌株的菌落和形態(tài)特征Fig. 1 Morphological and cultural characteristics of actinomyces LYZ0255

培養(yǎng)基 Culturemedium 氣生菌絲 Aerialhypha 基內(nèi)菌絲 Substratehypha 可溶性色素 Solublepigment 生長(zhǎng)狀況 Growthstate 高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基Gause’ssyntheticagar灰白色Graywhite灰色Gray黃白色Yellowwhite慢Slowly克氏一號(hào)合成培養(yǎng)基Krassilnikov’ssyntheticagar白色White褐色Brown黃白色Yellowwhite慢Slowly察氏瓊脂培養(yǎng)基Czapek’sagar灰色Gray灰色Gray -快Quickly葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基Glucoseasparagineagar白色White褐色Brown微黃白色Yellowishwhite快Quickly葡萄糖酵母膏瓊脂Glucoseyeastextractagar灰色Gray灰褐色Taupe琥珀色Amber快Quickly淀粉瓊脂培養(yǎng)基Starchagar黃色Yellow灰色Gray琥珀色Amber快Quickly馬鈴薯塊培養(yǎng)基Potatodextroseagar灰色Gray橙黃色Orangeyellow微黃色Yellowish快Quickly

2.1.316S rDNA序列擴(kuò)增和分析 對(duì)拮抗菌株16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 400 bp的擴(kuò)增片段(圖3)，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示LYZ0255的16S rDNA的全序列由1 388 bp個(gè)堿基構(gòu)成。在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)結(jié)果顯示，與其同源性高的菌株均為鏈霉菌屬(Streptomyces)，相似率在98.34～99.71%，其中S.albidoflavus(Z76676)與之相似率最高，為99.71%。基于與其同源性較高的菌株的16S rDNA的全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，該菌株與S.albidoflavus(Z76676)聚于同一個(gè)進(jìn)化分支上(圖4)，與同源性比對(duì)結(jié)果一致，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化鑒定結(jié)果將拮抗菌鑒定為微白黃鏈霉菌S.albidoflavus。

圖2 菌株LYZ0255生理生化特性Fig. 2 Physiological and biochemical characteristics of strain LYZ0255

圖3 菌株LYZ0255 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 Polymerase chain reaction amplification results of the strain LYZ0255

M: Marker; L-1/L-2: LYZ0255擴(kuò)增序列。

L-1/L-2: The amplification sequence of LYZ0255.

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的拮抗菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of the antagonistic strain

2.2 放線菌LYZ0255對(duì)紅豆草殼二孢的抑菌作用

2.2.1對(duì)菌絲生長(zhǎng)的的抑制效果 平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，該鏈霉菌菌株對(duì)紅豆草殼二孢表現(xiàn)出很強(qiáng)的拮抗作用，在對(duì)照長(zhǎng)滿全皿，對(duì)照平板上紅豆草殼二孢直徑為63.1 mm時(shí)，對(duì)峙平板中紅豆草殼二孢直徑為16.2 mm(圖5),相對(duì)抑菌率達(dá)74.33%。

圖5 拮抗菌對(duì)紅豆草殼二孢菌絲的平板對(duì)峙試驗(yàn)Fig. 5 Dural culture method of the antagonistic strain inhibit Ascochyta onobrychidis

拮抗菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)菌絲抑制結(jié)果顯示，待對(duì)照長(zhǎng)滿全皿時(shí)，A-SFB平板病原菌菌落直徑與SFB處理、對(duì)照均呈極顯著差異(P<0.01)，其中A-SFB平板對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑菌率達(dá)80.95%(圖6)，對(duì)紅豆草殼二孢病菌菌絲表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用；而SFB平板菌落生長(zhǎng)狀況與無(wú)菌水處理一致，均對(duì)紅豆草殼二孢菌絲生長(zhǎng)沒有抑制作用。

2.2.2對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用 用A-SFB處理紅豆草殼二孢病原菌孢子，其抑制病原孢子萌發(fā)效果顯著，抑制率達(dá)93.87%；而SFB處理和對(duì)照處理一致，紅豆草殼二孢病原孢子多數(shù)已經(jīng)萌發(fā)(圖7)，說(shuō)明SFB對(duì)紅豆草病原菌孢子萌發(fā)沒有影響。

3 討論與結(jié)論

目前，對(duì)于紅豆草殼二孢引起的葉斑和黑莖病防治研究甚少，只通過(guò)室內(nèi)接種篩選出埃斯基為抗病品種[8]，和僅通過(guò)平板對(duì)峙發(fā)現(xiàn)沙打旺埃里磚隔孢對(duì)紅豆草殼二孢有一定的抑制作用[23]，因此尋找經(jīng)濟(jì)高效、能夠保證生態(tài)安全和具有開發(fā)潛力的生物防治手段是解決這一問(wèn)題的有效途徑。本研究通過(guò)對(duì)分離得到的一株明顯抑制紅豆草殼二孢生長(zhǎng)的放線菌菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定和16S rDNA序列分析，將其鑒定為微白黃鏈霉菌，該菌株在形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列等方面參考模式菌株的相關(guān)信息[15,22]與微白黃鏈霉菌基本一致，只在碳源利用方面與模式菌株存在細(xì)微差異，模式菌株不能利用蔗糖，而該菌株可以利用，這可能是菌株之間存在變異的結(jié)果；同時(shí)拮抗菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲和孢子萌發(fā)的抑制試驗(yàn)結(jié)果均顯示，SFB處理和對(duì)照結(jié)果相同，排除了SFB對(duì)病原菌的影響，起抑制作用的即為該拮抗菌株。

圖6 拮抗菌對(duì)紅豆草殼二孢菌絲的抑菌效果和抑菌率Fig. 6 Inhibitory effect of antagonistic strain sterile fermentation broth to mycelium and the inhibitory rates

不同小寫字母表示經(jīng)Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。

Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level by DMRT; different capital letters show significant differences at the 0.01 level by DMRT.

圖7 拮抗菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)紅豆草殼二孢孢子萌發(fā)的影響Fig. 7 Effect of the strain LYZ0255 sterile fermentation broth on spore germination of Ascochyta onobrychis

鏈霉菌在植物病害生物防治方面被廣泛應(yīng)用于真菌引起的病害，并且利用鏈霉菌的代謝產(chǎn)物開發(fā)成微生物源農(nóng)藥防治植物病害是其在生物防治中最主要的應(yīng)用形式，第一個(gè)實(shí)用化的農(nóng)用抗生素殺稻瘟菌素能顯著抑制水稻紋枯病菌。有研究表明,微白黃鏈霉菌具有抗菌活性，Chao等[24]發(fā)現(xiàn)微白黃鏈霉菌可以有效抑制葉霉病菌(Passalorafulva)，本研究通過(guò)該拮抗放線菌平板對(duì)峙試驗(yàn)和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)以及孢子萌發(fā)影響的測(cè)定，證明了微白黃鏈霉菌對(duì)紅豆草殼二孢有良好的抑制作用，說(shuō)明其在紅豆草殼二孢葉斑和黑莖病生物防治和應(yīng)用中潛力巨大，但是該菌株發(fā)酵液中哪些成分在起抑制作用、作用機(jī)理和溫室及大田防效等問(wèn)題還需進(jìn)一步探究。

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