張世超，王英哲，金 艷，陳晶晶，王 瑩，徐 博

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118； 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130124)

紫花苜蓿(Medicagosativa)雜種優(yōu)勢較強(qiáng)。在生產(chǎn)中，為了使這一優(yōu)勢得到廣泛的利用，授粉的控制體系尤為重要，保證它的穩(wěn)定性和高效性十分必要，雄性不育(male sterility)是最具有代表性的途徑之一[1]。其中的細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)更易于找到保持系從而實(shí)現(xiàn)“三系”配套，應(yīng)用前景十分廣闊[2-3]。2000年以來，如何綜合利用轉(zhuǎn)基因和分子標(biāo)記等遺傳技術(shù)對苜蓿CMS進(jìn)行研究[4]成為熱點(diǎn)。如，Barcaccia等[5]利用RAPD技術(shù)，對減數(shù)分裂過程中苜蓿的突變體進(jìn)行標(biāo)記，找到了許多具有特異性標(biāo)記的突變體，并通過這些特異性標(biāo)記對突變體中的2n配子形成機(jī)制進(jìn)行了新的研究，并用QTL技術(shù)將二倍體苜蓿群體的大花粉基因(jumbo pollen，jp)定位于6號染色體上，推測出形成多核小孢子的基因在6號連鎖群上。Rosellini等[6]成功將雄性不育基因Bamase轉(zhuǎn)入苜蓿，發(fā)現(xiàn)影響花粉正常發(fā)育的原因主要是胼胝質(zhì)酶的合成與分泌，因此可通過改變胼胝質(zhì)酶的含量也能得到雄性不育植株。

由于雜交種的生產(chǎn)涉及一些商業(yè)秘密，針對紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育的理論研究較少，多集中在細(xì)胞核[7]，對選育紫花苜蓿的新雜交品種推動不大。而2008年通過衛(wèi)星搭載公農(nóng)1、2、3號紫花苜蓿后代，新發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿雄性不育材料(MS-GN)[8]，其特性表現(xiàn)為無花粉或花粉敗育[9]。在不育系(MS-GN)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步雜交育種，成功獲得4份紫花苜蓿雄性不育系材料，其不育特性近100%且十分穩(wěn)定[8]。再將已獲得的材料不斷運(yùn)用回交、測交的方式，終于選育出3份不育率超高的保持系材料(后代不育率高于95%)[8]，這3份材料對細(xì)胞質(zhì)雄性不育特性有穩(wěn)定的高維持性，對今后雄性不育方向的理論研究和應(yīng)用價(jià)值起到了至關(guān)重要的作用。但在紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)不育遺傳基礎(chǔ)、遺傳模式和不育機(jī)理上需要進(jìn)一步研究，尤其在優(yōu)良恢復(fù)系篩選等方面也需要進(jìn)一步探索。

本研究對不育系MS-GN-1A的不育特征進(jìn)行分析，利用SSR分子標(biāo)記法，以不育恢復(fù)基因所在的引物類群為基礎(chǔ)，完成初步定位，以期對未來紫花苜蓿雄性不育系的研究提供一點(diǎn)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院于洪柱等[8]選育的紫花苜蓿不育系MS-GN-1A為母本，恢復(fù)系MS178為父本配置雜交組合產(chǎn)生F1代(144株)，在 2014年獲得雜交F1代種子，2015年將F1代種子種植于大田中。使用人工方式強(qiáng)迫自交獲得F2代種子，2016年種植于大田中，得到F2代分離群體(221株)。

1.2 方法

1.2.1花粉育性鑒定 在紫花苜蓿開花盛花期，取父母本、F1和F2代群體單株未開放的小穗于冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室。采用花粉染色I(xiàn)2-KI染色法進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察花粉育性情況[10-11]。育性觀察統(tǒng)計(jì)并計(jì)數(shù)以后，并取父母本、F1和F2代群體的單株的葉片提取 DNA 用于連鎖分析[12]。

1.2.2葉片DNA的提取和PCR反應(yīng) 根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行葉片DNA的提取，將提取后的DNA置于在-20 ℃儲存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用 30%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，進(jìn)行核酸燃料染色后觀察統(tǒng)計(jì)并拍照。

1.2.3多態(tài)性標(biāo)記的篩選 參照F2育性觀察結(jié)果分析，結(jié)合田間植株表現(xiàn)[13]，將所有植株劃分為可育和不育兩組，并構(gòu)建可育和不育DNA混池，混池DNA從可育和不育植株組DNA中各隨機(jī)抽取20個樣品。

通過已發(fā)表的紫花苜蓿遺傳圖譜中公布的SSR引物 (共8條連鎖群296個SSR引物)[14]，隨機(jī)選取160條作為初步篩選的引物。通常在 SSR-PCR 反應(yīng)完成后，PCR 產(chǎn)物會先經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，并進(jìn)行多態(tài)性條帶鑒定，而后再進(jìn)行聚丙烯胺凝膠電泳。觀察基因池之間的擴(kuò)增條帶是否存在多態(tài)性。

初次驗(yàn)證篩選引物后發(fā)現(xiàn)含有多態(tài)性位點(diǎn)的染色體連鎖群，找到這一條染色體上的所有引物序列。以上引物均根據(jù)文獻(xiàn)中提供的引物序列[14]，由上海生工生物技術(shù)公司合成引物。

1.2.4電泳條帶統(tǒng)計(jì)與重組率計(jì)算 在顯微鏡下觀察 F2群體單株是否可育，并結(jié)合田間形態(tài)觀察的結(jié)果，確定F2單株所表現(xiàn)的基因型。將可育單株的基因型標(biāo)記為“A”，不育單株的基因型標(biāo)記為“B”。同時(shí)利用具有特異性的SSR引物對F2單株基因組進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并進(jìn)行核酸染料染色，對得出的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如果擴(kuò)增出的群體單株目的基因條帶與不育基因池相同，那么將此條帶標(biāo)記為“B”，若與可育基因池條帶相同，則標(biāo)記為“A”，如果條帶與不育和可育基因池均不相同(雜合型)，則標(biāo)記為“H”。統(tǒng)計(jì)條帶后做成Excel表格，再通過遺傳作圖軟件Joinmap 4.0構(gòu)建遺傳圖譜，將3.0作為 LOD 最小值，最大遺傳距離為 50 cM。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉育性判定

淀粉與I2-KI溶液反應(yīng)，在顯微鏡下呈現(xiàn)為深藍(lán)色?？捎幕ǚ哿？梢院铣傻矸?，顯微鏡下可以看到深藍(lán)色的花粉顆粒細(xì)胞，反之不育株的花粉不能被染色，呈現(xiàn)為黃色或淺褐色。有些植株在盛花期的花藥中，并沒有花粉顆粒的存在，所以也就不能被I2-KI染成深藍(lán)色。這說明在植株生長發(fā)育至開花期，一部分植株的花粉粒沒有正常合成，導(dǎo)致花藥在發(fā)育過程中就發(fā)生不正常的改變，最終形成不育植株[15]。

于盛花期對大田種植的221株F2代群體單株花粉顆粒染色后，顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)出，不育的F2代株數(shù)為57，可育F2代株數(shù)164，并沒有觀察到半不育植株。

2.2 紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的SSR標(biāo)記

2.2.1SSR引物的篩選 首先對隨機(jī)挑選的160對引物(從296對引物中隨機(jī)選出)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有引物都能擴(kuò)增出多條條帶，但其中具有特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物有2對。分別是Mt2c12和AW166。圖1為 Mt2c12和AW166 的所在位置，即部分引物的篩選結(jié)果，6號引物Mt2c12和7號引物AW166其擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異的多態(tài)性。

根據(jù)文獻(xiàn)[14]中的引物，將有多態(tài)性條帶的引物在文章中找到相應(yīng)的類群Composite5，將該類群上所有引物進(jìn)行合成，現(xiàn)已完成該類群的引物篩選，結(jié)果在兩個基因池間發(fā)現(xiàn)了5個具有多態(tài)性的 SSR 引物，分別為Mt2c12、AW166、BI68、AW776153和BG267。圖2為BI68和BG267所在組中部分引物篩選結(jié)果。

2.2.2恢復(fù)基因定位 把Mt2c12、BI68、AW776153和BG267分別作為擴(kuò)增引物，發(fā)現(xiàn)相對應(yīng)的分別有21、16、32和28株擴(kuò)增條帶與其對應(yīng)的基因池不同(即為交換)，其他個體的 DNA 擴(kuò)增條帶均與其對應(yīng)基因池相對應(yīng)(圖3為BG267的部分電泳條帶)。將所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析輸入軟件后，結(jié)果如圖4所示，與恢復(fù)基因連鎖的SSR引物 BI68、Mt2c12、BG267和AW776153，它們的遺傳距離分別為 19.0、20.9、44.6和72.1 cM。并且與恢復(fù)基因連鎖最為緊密的是引物BI68。

圖1 部分引物初步篩選結(jié)果Fig. 1 Initial screening results of partly screened SSR primers

M,100 bp ladder.圖2，圖3同。Marker in Figure 2 and Figure 3 is the same as Figure 1.

圖2 部分引物篩選結(jié)果Fig. 2 Screening results of partly screened SSR primers

在篩選引物過程中，擇優(yōu)選取，挑選與恢復(fù)基因Rf較近的引物，所以，在最后遺傳作圖的時(shí)候，隱去了AW166這個引物。

圖3 SSR引物BG267在基因池和F2可育株的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 Results of PCR amplification of BG267 marker gene pools and F2 fertile individuals

1-18：植株個體編號；Bulk S：不育基因池；Bulk F：可育基因池；S：父本 F：母本。

1-18： Plant individual number； Bulk S： Sterility gene pool； Bulk F： Fertile gene pool； S： Male parent； F： Female parent.

圖4 紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf的遺傳連鎖圖Fig. 4 Composite genetic linkage map of 5 primers of cytoplasmic male sterile restorer gene in alfalfa

3 討論與結(jié)論

本研究使用紫花苜蓿不育系MS-GN-1A為母本，恢復(fù)系MS178為父本做組合構(gòu)建BSA分離群體，所獲得的F1代均表現(xiàn)為雄性可育，在大田種植了221株F2代群體單株，盛花期將花粉顆粒染色后，顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)出，不育的F2代株數(shù)為57，可育F2代株數(shù)164，并沒有觀察到半不育植株。本研究通過篩選紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記，進(jìn)行染色體定位和不育恢復(fù)基因的定位分析，首先找到2條引物Mt2c12、AW166具有多態(tài)性條帶，找到相應(yīng)的染色體，將所有引物進(jìn)行合成、篩選、定位后發(fā)現(xiàn)，與恢復(fù)基因連鎖的SSR引物BI68、Mt2c12、BG267和AW776153，遺傳距離分別為19.0、20.9、44.6和72.1 cM。其中BI68與恢復(fù)基因連鎖最為緊，將恢復(fù)基因定位于Composite5連鎖群上。細(xì)胞質(zhì)雄性恢復(fù)基因的定位是紫花苜蓿雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)[16]。隨著分子標(biāo)記越來越迅速的發(fā)展及其被更加廣泛的應(yīng)用，許多主要農(nóng)作物用于分子標(biāo)記的指紋圖譜被系統(tǒng)化、全面化[17]，這也是分子標(biāo)記定位到目前為止，在各種農(nóng)作物的育性基因定位的試驗(yàn)中，科學(xué)研究者首選方法的原因[18]。目前，越來越多物種的微衛(wèi)星標(biāo)記圖譜密度的增加和技術(shù)都得到了很好的發(fā)展[19]，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)將在基因定位中發(fā)揮更大的作用[20]。因此本研究采用SSR標(biāo)記和BSA法來定位紫花苜?；謴?fù)系MS178的恢復(fù)基因。雖然19.0所cM是一個較遠(yuǎn)的標(biāo)記，但是為進(jìn)一步精細(xì)定位提供了基礎(chǔ)。

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