張向暉,彭永臻,賈方旭,韓金浩,馬 斌,何 洋

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外源自誘導(dǎo)物對厭氧氨氧化的影響

張向暉,彭永臻*,賈方旭,韓金浩,馬 斌,何 洋

(北京工業(yè)大學(xué),國家工程實(shí)驗(yàn)室,北京市污水脫氮除磷處理與過程控制工程技術(shù)研究中心,北京 100124)

厭氧氨氧化作為污水生物脫氮新工藝,存在著菌群倍增時(shí)間長,一旦隨水流失,脫氮性能會(huì)急劇下降的問題.N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHLs)作為一類典型的誘發(fā)群體感應(yīng)效應(yīng)的自誘導(dǎo)物,可能會(huì)激活部分基因的表達(dá).有研究表明兩種常見的AHLs:C6-HSL和C8-HSL對厭氧氨氧化菌群的成膜機(jī)制有促進(jìn)作用.本試驗(yàn)通過外添加C6-HSL和C8-HSL兩種自誘導(dǎo)物,深入探究其對厭氧氨氧化菌群的影響.結(jié)果表明濃度為0.5g/L的AHLs會(huì)抑制厭氧氨氧化菌群的生長,但能提高其脫氮性能,并顯著促進(jìn)聯(lián)氨合成酶(hydrazine synthase subunit A,)基因的表達(dá),但兩種AHLs的促進(jìn)作用有所差別,相同濃度的C8-HSL較C6-HSL對基因表達(dá)的促進(jìn)作用更為明顯.

厭氧氨氧化；群體感應(yīng)；N-?；呓z氨酸內(nèi)酯；聯(lián)氨合成酶

厭氧氨氧化(Anammox)是指厭氧氨氧化菌(AnAOB)在缺氧條件下以亞硝酸鹽作為電子受體,將氨氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)獾倪^程[1-3].與傳統(tǒng)脫氮工藝相比,Anammox工藝不需外加有機(jī)碳源且無需曝氣,大大節(jié)省了能耗并降低了處理成本[4].但因AnAOB倍增時(shí)間長(約10~14d[5]),少許的污泥流失就會(huì)引起Anammox工藝的脫氮性能減弱.

群體感應(yīng)(QS)是一種微生物中普遍存在的通訊機(jī)制[6],微生物通過分泌自誘導(dǎo)物(AI)來感知周圍的細(xì)胞密度[7],從而調(diào)控基因表達(dá)[8],如生物膜的形成[9-10]、毒力因子的表達(dá)[11]、生物發(fā)光[12]等.AnAOB為革蘭氏陰性菌,具有能分泌N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs)自誘導(dǎo)物的群體感應(yīng)系統(tǒng)[13],有研究表明Anammox混合液的上清液和泥相中都能提取出C6-HSL和C8-HSL兩種AHLs,并推測這兩種自誘導(dǎo)物對AnAOB的生長速率和活性都存在積極的影響[14],但至今鮮有文章報(bào)道AHLs對AnAOB脫氮性能以及與Anammox反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)的影響,因此本試驗(yàn)選取C6-HSL和C8-HSL兩種信號分子,通過外添加的方式考察其對AnAOB生長速率、活性以及功能基因表達(dá)的影響.

1 材料與方法

1.1 污泥來源與培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用污泥取自穩(wěn)定運(yùn)行的厭氧氨氧化UASB反應(yīng)器,通過菌體對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)接,對AnAOB進(jìn)行富集培養(yǎng)[15],連續(xù)轉(zhuǎn)接7次后, AnAOB含量占總菌含量的73%.在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,對Anammox污泥進(jìn)行低強(qiáng)度的超聲(30s, 250W),使菌群分布均勻.

基礎(chǔ)培養(yǎng)液(g/L):NaNO20.4,NH4Cl 0.33, NaCl 1.0,MgCl2·6H2O 0.5,KH2PO40.2,KCl 0.3, CaCl2·2H2O 0.015,TES 2.292,Na2S·9H2O 0.012, NaHCO32.52,微量元素溶液1:1000(g/L):HCl 10mL/L, FeCl2·4H2O 1.5, CoCl2·6H2O 0.19, MnCl2·4H2O 0.1, ZnCl20.07,H3BO30.006, Na2MoO4·2H2O 0.036, NiCl2·6H2O 0.024, CuCl2·2H2O 0.002;pH= 7.0~7.3.通過曝氮?dú)庖约疤砑覰a2S×H2O去除培養(yǎng)基中的溶解氧.外添加自誘導(dǎo)物培養(yǎng)基(g/L): C6-HSL 0.5或C8-HSL 0.5,其他成分與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同.C6-HSL和C8-HSL均購置自Sigma公司.

1.2 外添加自誘導(dǎo)物實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行:空白對照組、C6-HSL組(AHLs-Ⅰ)、C8-HSL(AHLs-Ⅱ)組,每組均做2組平行實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為60mL的血清瓶,有效反應(yīng)體積為40mL.在60mL的血清瓶中加入36mL的培養(yǎng)基,并加入4mL經(jīng)過轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)OD600=0.25的Anammox污泥,向血清瓶中曝氮?dú)馊コ渲械娜芙庋?后密封壓蓋,保證血清瓶中的厭氧環(huán)境.血清瓶置于35℃、140r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng).每間隔1d取一次樣品,測定其中NH4+- N、NO2--N 和NO3--N的濃度變化, AnAOB的含量變化,以及聯(lián)氨合成酶基因的表達(dá)情況.

1.3 檢測指標(biāo)及分析方法

水質(zhì)檢測指標(biāo)包括NH4+-N、NO2--N 和NO-3-N,采用DIONEX IC S-2000離子色譜儀進(jìn)行測定,柱子型號為:Dionex IonPac AS18- 4μm,pH值采用探頭測定,探頭型號為德國WTWMulti340i.

1.4 DNA、RNA的提取和RT-PCR、qPCR

本實(shí)驗(yàn)提取樣品中的mRNA和DNA,對DNA進(jìn)行16S rRNA定量PCR的測定,隨后對提取出的樣品mRNA進(jìn)行RT-PCR,得到相應(yīng)的cDNA.本試驗(yàn)選取Anammox反應(yīng)過程中最具有特異性的聯(lián)氨合成酶基因()來表征Anammox反應(yīng)的進(jìn)行情況[16].對cDNA中的聯(lián)氨合成酶基因進(jìn)行定量PCR測定,最后用測定拷貝數(shù)與16S rRNA拷貝數(shù)的比值來表示單位AnAOB中聯(lián)氨合成酶基因的表達(dá)量.

表1 real-time qPCR所用引物及其核苷酸序列

DNA、RNA分別從0.5mL的樣品中獲得,DNA的提取方法參照QIAGEN公司DNeasy Blood&Tissue試劑盒.提取RNA的樣品在用RNase-free處理過的離心管中進(jìn)行離心(20000g, 15min,4℃).離心后的生物相溶于150μL的TRIzol?(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)并儲(chǔ)存于-80℃[17].RNA提取使用RNeasy kit(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany).反轉(zhuǎn)錄選用two-step RT-PCR Sensiscript kit(QIAGEN, GmbH, Hilden, Germany),取12μL的提取好的RNA于20μL的反轉(zhuǎn)錄混合體系中,于37℃3h后合成cDNAs,并儲(chǔ)存于-20℃.選用熒光素酶RNA(Luciferase control RNA)作為內(nèi)標(biāo)物[18], rpoB和16S rRNA作為管家基因(回收率詳見表4).本實(shí)驗(yàn)中所進(jìn)行的qPCR擴(kuò)增效率達(dá)93%~ 96%,2>0.9,qPCR體系為10μL:無菌水3.135μL, buffer 5μL,BAS(20mg/mL) 0.065μL,前引物0.4μL,后引物0.4μL,DNA 1μL. qPCR反應(yīng)條件為:93℃預(yù)變性3min,96℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán),72℃延伸5min(qPCR使用的引物詳見表1).

2 結(jié)果與討論

2.1 自誘導(dǎo)物C6-HSL和C8-HSL對Anammox脫氮性能的影響

探究外添加自誘導(dǎo)物對Anammox脫氮性能的影響發(fā)現(xiàn),從實(shí)驗(yàn)的第1d開始,外添加的自誘導(dǎo)物就對Anammox的氨氮降解能力有顯著的影響(氨氮濃度變化詳見圖1(a)),在24h內(nèi)C6-HSL組和C8-HSL組的氨氮降解速率分別達(dá)到了0.282和0.455mmol/(L·d),而空白組僅為0.084mmol/(L·d).在之后的6d內(nèi),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,C6-HSL組和C8-HSL組的氨氮降解速率不斷升高(氨氮、亞硝酸鹽氮的降解速率詳見表2),但升高的幅度有所降低,這可能是因?yàn)樽哉T導(dǎo)物的降解[14],導(dǎo)致對Anammox的脫氮促進(jìn)作用的減弱[14].在實(shí)驗(yàn)的6d內(nèi),C6-HSL組、C8-HSL組平均氨氮降解速率分別達(dá)到0.357、0.511mmol/ (L·d),而空白組的平均氨氮降解速率僅為0.162mmol/(L·d),實(shí)驗(yàn)組的氨氮降解速率明顯高于空白組,此外,對比C6-HSL組和C8-HSL組,可以發(fā)現(xiàn)C8- HSL組的氨氮降解速率更快,但總體的趨勢與C6-HSL組相同,可見C8-HSL自誘導(dǎo)物對Anammox降解氨氮的促進(jìn)作用更顯著.

Anammox對亞硝酸鹽氮的轉(zhuǎn)化趨勢與氨氮降解趨勢基本相同(亞硝酸鹽氮濃度詳見圖1(b)).但實(shí)驗(yàn)的前2d,出現(xiàn)了亞硝酸鹽氮和氨氮去除量的比值明顯高于理論值1.32的現(xiàn)象(亞硝酸鹽氮和氨氮去除量比值變化詳見圖2(a)),硝酸鹽的生成與氨氮的降解比值也低于理論值0.26(硝酸鹽生成與氨氮降解比值變化詳見圖2(b)).猜測由于反應(yīng)體系中的反硝化菌的增長,導(dǎo)致亞硝酸鹽氮的去除量高于理論值,而生成的硝酸鹽因反硝化作用快速降解,導(dǎo)致亞硝酸鹽氮與氨氮的去除量比值高于1.32,而硝酸鹽生成量與氨氮降解量比值低于0.26.

在進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)之前,為減小各個(gè)血清瓶中的Anammox污泥的差異性,對Anammox菌群進(jìn)行了低強(qiáng)度的超聲,打散聚集的菌群,后將絮體菌群等體積加入各個(gè)血清瓶中.Yu等[23]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超聲處理,污泥中的部分細(xì)胞將破碎,胞內(nèi)可溶性的有機(jī)物將破胞而出,成為反硝化菌的有機(jī)底物.因此在反應(yīng)開始階段,反硝化菌以可溶性有機(jī)物作為碳源,亞硝酸鹽、硝酸鹽作為氮源進(jìn)行反硝化反應(yīng).隨著碳源被消耗盡,反硝化反應(yīng)中失去了電子供體,反硝化菌無法降解亞硝酸鹽氮和硝酸鹽,血清瓶內(nèi)AnAOB占主導(dǎo),降解亞硝酸鹽氮和降解氨氮的比值也逐漸趨于理論比值1.32.生成硝酸鹽和降解氨氮的比值也趨于理論值0.26. C6-HSL組和C8-HSL組對亞硝鹽氮的降解速率要明顯高于空白組,C6-HSL組亞硝酸鹽氮的降解速率從第1d的0.172mmol/(L·d) 上升到第6d的0.667mmol/ (L·d),C8-HSL組亞硝酸鹽氮的降解率從第1d的0.200mmol/(L·d)上升到第6d的1.204mmol/(L·d),而空白組僅從第1d的0.011mmol/(L·d)上升到第6d的0.319mmol/(L·d).第6d,C6-HSL組的氨氮和亞硝酸鹽氮降解速率達(dá)到空白組的2倍,C8-HSL組達(dá)到空白組的3倍.本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Tang等的結(jié)果接近,C6-HSL與C8-HSL都對Anammox菌的脫氮性能有一定的促進(jìn)作用[14].

表2 氨氮與亞硝酸鹽氮降解速率

2.2 外添加C6-HSL、C8-HSL對厭氧氨氧化菌生長情況的影響

為探究外添加自誘導(dǎo)物對AnAOB生長情況的影響,對AnAOB中的聯(lián)氨合成酶基因豐度進(jìn)行檢測,用聯(lián)氨合成酶基因豐度的變化來表征AnAOB的生長情況. 3組實(shí)驗(yàn)表明;AnAOB的增長率基本呈現(xiàn)逐漸上升趨勢,但增長速度有明顯的差別(聯(lián)氨合成酶基因豐度變化詳見圖3).研究中發(fā)現(xiàn)與空白組相比較,C6-HSL組和C8-HSL組AnAOB菌群的生長更緩慢.C6-HSL組中AnAOB的DNA含量從反應(yīng)開始階段的7×104copies/mL增長到第6d的9.8×104copies/ mL,C8-HSL組第6d時(shí)增長到11.8×104copies/ mL,而空白組第6d時(shí)已增長到15×104copies/mL.在反應(yīng)的開始的24h內(nèi),3組的增長率都<5%,到了第6d C6-HSL組、C8-HSL組和空白組的增長率分別達(dá)到7.6%、16.9%和17.8%,6d內(nèi)增長率均值分別為5.6%、8.1%和13%(AnAOB增長率變化詳見表3).空白組的AnAOB的生長情況從含量和增長速率都要明顯高于外添加自誘導(dǎo)物組,可見實(shí)驗(yàn)選取的2種自誘導(dǎo)物對AnAOB的生長并沒有促進(jìn)作用,反而有抑制作用,這與多數(shù)報(bào)道的研究結(jié)果相反,De等[24]認(rèn)為AHLs能加大AnAOB的生長,Tang等[14]則指出C6-HSL、C8-HSL這兩種AHLs能加快AnAOB的生長速率[14].而在有關(guān)AHLs對菌群生長速率影響的探究中,Hu等[25]表明不同濃度的AHLs對菌群生長速率的影響有很大的差別,對比外添加5, 50, 500nmol/L的AHLs,只有外添加5nM自誘導(dǎo)物組的生物量生長速度大于空白組,外添加自誘導(dǎo)物50nM和500nmol/L組的生物量生長速度都小于空白組[25].本實(shí)驗(yàn)選取了0.5g/L的自誘導(dǎo)物濃度,約為2mmol/L,高于抑制生物量生長的濃度.因此可能出現(xiàn)添加自誘導(dǎo)物組生物量生長速度不如空白組的現(xiàn)象.Hu等還指出,高濃度(500nmol/L)的AHLs能夠刺激胞外聚合物的生成,而本試驗(yàn)中選取的AHLs濃度高于500nmol/L,能刺激胞外聚合物的生成.Chen等[27]在實(shí)驗(yàn)中證明,胞外聚合物的合成需要先消耗細(xì)胞內(nèi)的部分能量,剩余的能量再用于生物量的增長.因此本實(shí)驗(yàn)中兩組實(shí)驗(yàn)組可能因自誘導(dǎo)物(C6-HSL、C8-HSL)刺激胞外聚合物的生成,先消耗了細(xì)胞內(nèi)的部分能量,使細(xì)胞的生長增值滯后,而出現(xiàn)了生物量的增長不如空白組的現(xiàn)象.

表3 AnAOB增長速率變化

圖3 聯(lián)氨合成酶基因豐度變化

2.3 C6-HSL、C8-HSL對hzsA基因表達(dá)的影響

研究發(fā)現(xiàn),隨著Anammox反應(yīng)的進(jìn)行,單位AnAOB的聯(lián)氨合成酶基因的表達(dá)也逐漸加強(qiáng),但在第1d,各組聯(lián)氨合成酶基因的表達(dá)情況相較起始都有一個(gè)明顯的下降,外添加C6-HSL組、C8-HSL組和空白組分別從第0時(shí)刻的24.5、30.8和19.5降低到第1d的12.6、20.6和12.7,這與脫氮性能探究中的氮元素的變化趨勢一致,認(rèn)為是反硝化菌增長,與AnAOB競爭氮素底物亞硝酸鹽,導(dǎo)致AnAOB的生長受到抑制,與Anammox活性相關(guān)的聯(lián)氨合成酶基因的表達(dá)也受到抑制.從實(shí)驗(yàn)的第2d起,除個(gè)別樣品點(diǎn),如空白組的第1d~第3d有所起伏,其余總體呈現(xiàn)聯(lián)氨合成酶基因表達(dá)逐漸加強(qiáng)的趨勢.有所起伏的點(diǎn)推測可能是因?yàn)樵趍RNA提取和RT-PCR的過程中誤差偏大造成的,從回收率表可以看到如空白組第2d、C6-HSL組第0d以及C8-HSL組第3d的回收率低于0.5.比較添加外源自誘導(dǎo)物C6-HSL組、C8-HSL組和空白組的聯(lián)氨合成酶基因表達(dá)情況,可見添加外源自誘導(dǎo)物C6-HSL組和C8-HSL組的聯(lián)氨合成酶基因表達(dá)明顯強(qiáng)于空白組.外添加C6-HSL組、C8-HSL組和空白組分別從0時(shí)刻的24.5、30.8 和12.7增長到第6d的1588.7、2387.7和131(聯(lián)氨合成酶基因的表達(dá)豐度變化詳見圖4),C6-HSL組、C8-HSL組的基因表達(dá)豐度分別為空白組的12倍、18倍.因此,雖然高濃度的AHLs對AnAOB的生長有一定的抑制[25],但并沒有抑制Anammox相關(guān)基因聯(lián)氨合成酶基因的表達(dá).

表4 RT-PCR回收率

圖4 mRNA水平上聯(lián)氨合成酶基因豐度的變化

這也就能解釋為什么外添加AHLs的兩組AnAOB的生長情況不如空白組,但脫氮性能卻高于空白組,其內(nèi)在原因是添加的外源自誘導(dǎo)物C6-HSL和C8-HSL促進(jìn)了聯(lián)氨合成酶基因的表達(dá),因此脫氮性能也更好.

2.4 自誘導(dǎo)物AHLs誘導(dǎo)AnAOB基因表達(dá)的機(jī)理模型

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論模擬自誘導(dǎo)物AHLs誘導(dǎo)AnAOB基因表達(dá)的模型(模型詳見圖5).模型工作原理為:AnAOB分泌的AHLs與細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合蛋白相結(jié)合,形成AHLs—結(jié)合蛋白復(fù)合物并激活A(yù)nammox相關(guān)基因.只有AHLs—結(jié)合蛋白復(fù)合物能激活基因,未相互結(jié)合的AHLs和結(jié)合蛋白并不能單獨(dú)作用激活基因.當(dāng)Anammox相關(guān)基因被激活并開始表達(dá)后,AnAOB便具有了活性.此外,不同的AHLs誘導(dǎo)基因表達(dá)的能力也有所差別,如相同濃度下的C8-HSL較C6-HSL對Anammox 脫氮基因的激活能力更強(qiáng),C12-HSL對Anammox的生長率促進(jìn)作用較明顯[26].

圖5 高絲氨酸內(nèi)酯誘導(dǎo)AnAOB基因表達(dá)模型

AHLs:高絲氨酸內(nèi)酯; AmxR:AHLs結(jié)合蛋白;AmxR-AHLs complex:高絲氨酸內(nèi)酯-結(jié)合蛋白復(fù)合物;AmxA gene: AMX基因; Amx I:AMX活性蛋白

3 結(jié)論

3.1 C6-HSL、C8-HSL兩種自誘導(dǎo)物能提高Anammox的脫氮效率,且C8-HSL比C6-HSL對脫氮性能的影響更大.本試驗(yàn)中C6-HSL組的氨氮和亞硝態(tài)氮降解速率最高能達(dá)到空白組的2倍,C8-HSL組最高能達(dá)到空白組的3倍.因此認(rèn)為添加C6-HSL和C8-HSL可提高氮的去除率.

3.2 本實(shí)驗(yàn)選取的0.5g/L的C6-HSL、C8-HSL兩種自誘導(dǎo)物會(huì)抑制Anammox菌群的生長,且C6-HSL的抑制作用更為明顯.

3.3 C6-HSL、C8-HSL兩種自誘導(dǎo)物能夠促進(jìn)AnAOB功能基因聯(lián)氨合成酶基因的表達(dá),且C8-HSL的促進(jìn)作用更明顯,本試驗(yàn)中C6-HSL組、C8-HSL組的基因表達(dá)豐度最高能達(dá)到空白組的12倍、18倍.

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Effect of the exogenous autoinducers on the anaerobic ammonium oxidation (anammox).

ZHANG Xiang-hui, PENG Yong-zhen*, JIA Fang-xu, HAN Jin-hao, MA Bin, HE Yang

(Engineering Research Center of Beijing, National Engineering Laboratory for Advanced Municipal Wastewater Treatment and Reuse Technology, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)., 2018,38(5)：1727~1733

Nowadays, the anaerobic ammonium oxidation (anammox) process becomes a promising new way of removing nitrogen from wastewater. However, the performance of nitrogen removal is easy to be affected bysludge washout due to the extremely long doubling time of anammox bacteria (AnAOB).As a representative autoinducer of quorum sensing (QS) system, N-acyl-homoserine lactones (AHLs) may regulate the expression of certain genes involved in anammox reaction. Previous researches have indicated that C6-HSL and C8-HSL (two types of AHLs) could stimulate biofilm formation. Therefore, this study mainly focuses on the effect of the exogenous autoinducers (C6-HSL and C8-HSL) on anammox performance. The results showed that the growth of AnAOB was inhibited at AHLs concentration of 0.5g/L, however, the nitrogen removal rate could be enhanced by inducinggene expression in the presence of both C6-HSL and C8-HSL. Moreover, higher expression level ofgene in AnAOB was induced by the amendment of C8-HSL than C6-HSL at the same concentration level.

anammox；quorum sensing；N-acyl-homoserine lactones；

X703

A

1000-6923(2018)05-1727-07

2017-09-29

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51508008);北京市教委資助項(xiàng)目.

*責(zé)任作者, 教授, pyz@bjut.edu.cn

張向暉(1992-),女,浙江杭州人,北京工業(yè)大學(xué)碩士研究生,主要從事污水處理厭氧氨氧化工藝研究.發(fā)表論文1篇.