黃洋峰，蔣薇

(四川省人民醫(yī)院，成都 610000)

急性胰腺炎(AP)是由胰腺酶被激活而造成的胰腺及其周圍組織自我消化的急性炎癥[1]，膽道疾病、過量乙醇攝入、十二指腸液反流、高脂血癥等均可導致AP發(fā)生，是常見急腹癥。AP可分為急性水腫型胰腺炎和急性出血壞死型胰腺炎(ANP)。磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/磷酸化核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)信號通路廣泛存在于生物體內(nèi)，可影響細胞生長、凋亡以及蛋白質合成等，與臨床多種疾病有關[2]。目前，國內(nèi)外對p-mTOR/p70S6K信號通路在ANP發(fā)病過程中的作用機制研究較少，2016年2月～2017年6月，本文以大鼠ANP動物模型為基礎，通過雷帕霉素藥物干擾，觀察p-mTOR/p70S6K的生物學功能變化，探求ANP與p-mTOR/p70S6K信號通路之間的關系，尋找ANP的有效治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：SPF級SD雄性大鼠，體質量(200±20)g，6周齡，96只。許可證號：SCXK(川)2015-030，動物和試驗場地由成都里來生物科技有限公司提供。藥物：牛磺膽酸鈉(成都艾科達化學試劑有限公司，CAS號：145-42-6);雷帕霉素(成都艾科達化學試劑有限公司，CAS號：53123-88-9)。主要實驗試劑和儀器:ELISA試劑盒：腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素10(IL-10)購自上海茁彩生物科技有限公司，TUNEL試劑盒(In situ cell death detection kit-POD法，10279600)購自瑞士Roche公司，mTOR和p70S6K蛋白抗體購自美國Sigma公司。多聚甲醛(AR級)、伊紅液(AR級)、蘇木素(AR級)均購自珠海貝索生物技術有限公司；全自動生化分析儀(日本Sysmex)，Multlskan酶標儀(賽默飛世爾)，C2500低溫離心機(湖南湘儀)，轉輪式切片機(德國徠卡)，BMJ-Ⅲ型-099包埋機(中威電子)，PHY-Ⅲ型-U22病理組織漂烘儀(中威電子)。

1.2 動物模型建立及分組 應用Excel的隨機函數(shù)RAND將96只大鼠隨機分為3組，分別為空白對照組、ANP模型組和雷帕霉素組，每組32只。ANP模型組，以0.1 mL/min的速度向胰膽管逆行注射1 mL/kg的5%牛磺膽酸鈉誘導建立大鼠ANP模型[3]；雷帕霉素組，以0.1 mL/min的速度向胰膽管逆行注射1 mL/kg的5%牛磺膽酸鈉誘導制備大鼠ANP模型后，予0.5 mg/kg雷帕霉素腹腔注射；空白對照組開腹后，翻動十二指腸及胰腺3次，關腹。

1.3 大鼠血清淀粉酶(AMY)及TNF-α、IL-6和IL-10水平的檢測 于造模后3、6、12、24 h，每個時間點各組分別取大鼠8只，麻醉后，迅速從心臟采血，靜置60 min，置于4 ℃低溫離心機，以4 000 r/min、離心15 min，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清AMY水平；按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測不同時間大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.4 胰腺組織p70S6K和p-mTOR蛋白的檢測 將上述采血完畢的大鼠，解剖后，取每只大鼠的胰腺組織。于造模后3、6、12、24 h,采用Western blotting法檢測各組大鼠胰腺組織中p70S6K和p-mTOR蛋白表達水平。用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進行掃描分析，結果以目的蛋白相對表達量表示。目的蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值(IOD)/內(nèi)參積分光密度值(IOD)。

1.5 組織病理學的觀察 將已固定的造模后24 h的大鼠胰腺組織，經(jīng)乙醇梯度脫水后，再透明、石蠟包埋、切片，HE染色后，光鏡(400倍)下觀察組織病變。同時制備保存未經(jīng)HE染色的石蠟切片，用于后續(xù)TUNEL檢測。

1.6 胰腺細胞凋亡指數(shù)(AI)的檢測 采用TUNEL法。取“1.5”中制備好的待用石蠟切片，經(jīng)脫蠟水化后，按照TUNEL試劑盒操作說明，檢測胰腺細胞凋亡情況。每個標本切片隨機觀察10個高倍鏡(×200)視野，計算出細胞AI，AI=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%，取平均數(shù)。

2 結果

2.1 各組不同時間血清AMY及血清炎癥因子水平比較 與ANP模型組比較，各時間點雷帕霉素組大鼠血清AMY水平低(P均<0.05)；血清TNF-α水平除了在造模后12 h差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余時間點均低(P均<0.05)；各時間點血清IL-6均低(P均<0.05)；大鼠血清IL-10高(P<0.01)?？瞻讓φ战M與雷帕霉素組不同時間比較，P均<0.05。見表1。

2.2 胰腺組織p70S6K與p-mTOR蛋白表達比較 不同時間點，各組大鼠胰腺組織p70S6K與p-mTOR蛋白的表達情況見表2。不同時間點，均可觀察到大小約為70 kD的p70S6K蛋白條帶和大小約為289 kD的p-mTOR蛋白條帶。ANP模型組的p70S6K與p-mTOR蛋白表達均高于空白對照組(P均<0.01)，雷帕霉素組該兩種蛋白表達均低于ANP模型組(P均<0.01)，但仍高于空白對照組(P均<0.05)。

表1 各組不同時間血清AMY及炎癥因子水平比較

表2 各組不同時間點大鼠胰腺組織中p70S6K與p-mTOR蛋白表達比較

2.3 胰腺組織病理變化 空白對照組胰腺組織無壞死性改變；ANP模型組胰腺組織呈出血性壞死改變，胰腺間質有明顯水腫，大量的炎性細胞浸潤，可見斑片狀出血灶；雷帕霉素組胰腺組織呈水腫性改變，胰腺間質輕微水腫，少量的炎性細胞浸潤，未見出血灶，雷帕霉素組胰腺組織病變程度較輕。

2.4 各組胰腺細胞AI比較 造模后24 h，空白對照組、ANP模型組、雷帕霉素組AI分別為1.04±0.43、13.91±1.76、7.19±1.57。與空白對照組比較，ANP模型組、雷帕霉素組AI均高；與ANP模型組比較，雷帕霉素組低(P均<0.01)。

3 討論

ANP是一種常見的急腹癥，伴隨全身性的炎癥反應。在這個炎癥反應的過程中，會激活大量胰酶，如胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等[4]。當這些胰酶大量釋放后，會產(chǎn)生自身消化作用，傷及胰腺和胰腺旁組織，甚至導致組織壞死。組織壞死后，機體進一步釋放大量甚至過量的炎性介質，從而引起全身劇烈的炎性反應，因此胰酶自身消化以及先后激化的炎性反應也是ANP的病理基礎。

AMY可由胰腺泡細胞分泌，一般存在于胰腺泡細胞內(nèi)，當胰腺組織遭受致病因子侵襲，這些酶會大量釋放。臨床上的AP患者大多伴有血清AMY升高，AMY水平也常作為AP診斷及病情評估的重要指標之一[5]。本實驗中，AMY檢測結果表明，造模后ANP模型組大鼠血清AMY水平一直持續(xù)升高，經(jīng)雷帕霉素干預后，盡管AMY在24 h內(nèi)，依然呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢，但與ANP模型組比較，從造模后6 h開始，大鼠血清中AMY水平降低。

TNF-α和IL-6都屬于促炎性細胞因子。TNF-α能集聚并直接調節(jié)中性粒細胞和嗜酸性細胞，使全身的代謝和各種類型的細胞免疫反應紊亂，產(chǎn)生細胞毒性，影響細胞分裂、分化的正常進行[6]。IL-6主要由單核/巨噬細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞等分泌，是一種急性反應性蛋白，能誘導急性期炎性反應的產(chǎn)生，促進并調節(jié)炎癥反應中多種細胞的分裂、分化[7]。在發(fā)生急性炎癥時，TNF-α和IL-6水平均會升高。血清TNF-α和IL-6檢測結果表明，ANP模型組和雷帕霉素組大鼠血清TNF-α和IL-6水平均在12 h內(nèi)連續(xù)升高，直至第24 h開始出現(xiàn)下降。但經(jīng)雷帕霉素干預后，大鼠血清TNF-α水平除了在造模后12 h，其余時間點，雷帕霉素組TNF-α水平均低于ANP模型組；大鼠血清IL-6水平從造模后3 h開始，直至造模后24 h，雷帕霉素組均低于ANP模型組。血清IL-10具有多效性和兩面性，既能免疫促進，也能免疫抑制。其促進作用主要體現(xiàn)在能促進B細胞的增殖、分化；抑制作用主要體現(xiàn)在對單核/巨噬細胞的抑制[8]。對巨噬細胞，IL-10可以抑制其致炎性細胞因子的釋放，抑制活性氧中間體的產(chǎn)生；對于單核巨噬細胞，可抑制相關的NK細胞，抑制IFN-γ和TNF-α合成，這些炎性介質的釋放量，也反映了炎癥嚴重程度。本實驗中，ANP模型組大鼠血清IL-10水平呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢，造模后6 h達到峰值，此后逐漸降低，而雷帕霉素組大鼠血清IL-10從造模后3 h開始，直至末次檢測的24 h，一直持續(xù)升高。與ANP模型組比較，從造模后3 h檢測開始，直至24 h，雷帕霉素組IL-10水平均高于ANP模型組。推測當IL-10大量釋放時，抑制了單核/巨噬細胞對TNF-α和IL-6的合成，TNF-α和IL-6的水平均降低，從而減輕了炎癥反應。組織病理學檢測結果表明，ANP模型大鼠經(jīng)雷帕霉素干預后，胰腺組織病變程度減輕，癥狀得以改善。

mTOR屬于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)家族成員，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR可調控細胞凋亡、參與核糖體合成、蛋白質翻譯等細胞功能。p-mTOR是mTOR的磷酸化狀態(tài)，其水平高低反映了mTOR活化狀態(tài)，是mTOR信號通路被激活的重要生物學標志。p70S6K是核糖體40s小亞基S6蛋白激酶，在mTOR信號通路中，p70S6K是一個重要的分子，協(xié)調控制細胞增殖與分化，p70S6K可被p-mTOR激活，進而啟動翻譯過程從而控制細胞的多種病理生理過程。研究報道，p-mTOR/p70S6K與乳腺癌、血管瘤、消化系統(tǒng)腫瘤等密切相關[9]，但與ANP的相關性報道較少。本研究中，從造模后3、6、12、24 h的各組大鼠胰腺組織中均檢測到了p70S6K與p-mTOR蛋白表達，相對分子質量大小分別為70、289 kD。表明大鼠在患ANP時，mTOR被激活。當ANP大鼠經(jīng)雷帕霉素干預后，雷帕霉素組的p-mTOR和p70S6K蛋白表達均低于ANP模型組。mTOR包括mTOR復合物1(mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2)[10]。mTORC1由mTOR、mLST8及raptor組成，能感受生長因子、能量狀態(tài)、氨基酸信號、氧濃度等，以此調節(jié)某些與細胞生長代謝相關的過程，而mTORC2由mTOR、mLST8及rictor組成，能被生長因子激活以調節(jié)細胞生存、代謝及細胞骨架形成[11]。在ANP的病程中，當炎性介質大量釋放導致炎癥反應加劇時，胰腺局部受到的炎癥刺激或者缺氧時，PI3K/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信號通路被激活，mTORC2可激活Akt，Akt又影響mTORC1活性部分，共同發(fā)揮生物學功能[12]。mTOR磷酸化后，可進一步激活其下游分子p70S6K，啟動p70S6K的磷酸化狀態(tài)。p70S6K的激活，促進了細胞的增殖和分化，而增殖分化出的細胞繼續(xù)被炎癥因子侵蝕，釋放出更多炎性因子，形成一個惡性循環(huán)[13]。該循環(huán)內(nèi)，mTOR信號通路為關鍵。本研究采用TUNEL法檢測了胰腺細胞凋亡情況，結果表明，雷帕霉素組大鼠胰腺細胞AI與ANP模型組相比降低。結合本實驗炎性因子水平變化、p70S6K和p-mTOR蛋白表達結果以及細胞凋亡結果，推測其調控機制可能是因雷帕霉素能特異性地結合mTOR，從而抑制mTORC1的活性，并調節(jié)其下游活性分子p70S6K的水平，降低通路活性，抑制胰腺細胞增殖分化，抑制了炎癥反應，減少了炎癥因子的釋放，有效減輕胰腺組織病變程度。

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