鐘燁，楊光華，肖童，王曉濤，田煒，張國志

(1華北理工大學附屬醫(yī)院，河北唐山 063000；2華北理工大學醫(yī)學實驗中心)

近年來，甲狀腺癌發(fā)病率逐年增加，其中最常見的病理類型是甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[1]。目前PTC的治療主要采用手術(shù)切除治療和放射性131I治療，雖治療效果尚可，但是有一定的復發(fā)率[1～3]。盡管PTC預后良好且惡性程度低，但仍然有10%PTC具有侵襲性，部分患者采用常規(guī)的治療方法達不到理想效果[3]。因此近幾年來生物學治療成為該領(lǐng)域的研究熱點，已經(jīng)鑒定出多種癌基因參與人PTC的發(fā)生[4,5]。叉頭框(FOX)基因家族功能龐大，最早在1989年由Weigel等[6]研究證實，這種轉(zhuǎn)錄因子從酵母到人類都廣泛存在。作為FOX蛋白家族的重要成員， FOXQ1是一種可以調(diào)控細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，它與腫瘤的發(fā)病機制顯著相關(guān)[7]。近年研究表明FOXQ1作為一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，可以激活多條信號通路從而參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及細胞增殖等生物學功能[7, 8]。2017年8～12月，本研究通過siRNA沉默人TPC-1細胞中FOXQ1基因的表達，探討FOXQ1-siRNA對于TPC-1細胞侵襲遷移的影響及其可能的機制,為PTC的基因靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 TPC-1細胞由天津醫(yī)科大學醫(yī)學實驗中心贈予，用含10%胎牛血清(FBS)、1%青鏈霉素混合液的DMEM(高糖)培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2細胞孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基和FBS均購于Gibco公司，F(xiàn)OXQ1-siRNA、無義序列RNA購于蘇州吉瑪基因有限公司，RNA提取試劑盒購于日本TaKaRa公司、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京GenStar公司，SYBR Green qPCR Master Mix、FOXQ1引物及LipofectamineTM2000均購于美國 Invitrogen公司，兔抗人FOXQ1多克隆抗體購于英國Abcam公司，兔抗人MMP7、MMP9、AKT及p-AKT(Ser473)均購于美國CST公司，HR標記的山羊抗兔二抗、GAPDH抗體、Western相關(guān)試劑盒均購于上海碧云天公司，24孔Transwell小室購于美國Corning公司；Matrigel購于北京索萊寶科技有限公司。倒置高分辨率熒光顯微鏡購于日本OLYMPUS公司，qRT-PCR儀器購于中國香港Gene Company Iimited公司。

1.2 FOXQ1-siRNA轉(zhuǎn)染細胞的干擾效果評估 取處于對數(shù)生長期的細胞，然后將TPC-1細胞消化制備成單個的細胞懸液，將密度調(diào)整為3×105/mL后取出細胞懸液1 mL接種于六孔板中，放于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當融合率達到70%時隨機將細胞分為空白組、無義序列組及實驗組進行轉(zhuǎn)染；空白組中加入等量的磷酸鹽緩沖液，無義序列組中加入LipofectamineTM2000和帶有熒光標記的NC-siRNA(sense 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ ，antisense 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)，實驗組加入轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000及帶有熒光標記的FOXQ1-siRNA(sense 5′-GCACGCAGCAAGCC-AUAUATT-3′，antisense 5′-UAUAUGGCUUGCUGCG-UGCTT-3′)，在同樣的條件下轉(zhuǎn)染TPC-1細胞。每組設(shè)置3個復孔。6 h后換液，分別在24、48、72 h利用熒光倒置顯微鏡觀察熒光蛋白表達情況，當轉(zhuǎn)染效率達到80%以上，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)用于qRT-PCR、Western blotting進一步檢測FOXQ1-siRNA的干擾效率。

1.3 細胞FOXQ1基因mRNA相對表達量的檢測 采用qRT-PCR法。轉(zhuǎn)染48 h后，按TRIpure 說明書提取各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增。FOXQ1的上下游引物序列分別為5′-ATTTCTTGCTATTGACCGATGC-3′和5′-CCCAAGGAGACCACAGTTAGAG-3′。內(nèi)參GAPDH上下游引物序列分別為5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′和5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′。PCR擴增的條件: 預變性95 ℃、30 s，95 ℃、5 s， 60 ℃、30 s，延伸72 ℃、40 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，各組的FOXQ1的CT值均經(jīng)過GAPDH校正后，采用2-ΔΔCT法計算FOXQ1 mRNA相對表達量。每組設(shè)置3個復孔，進行平行實驗3次。

1.4 細胞FOXQ1、p-AKT、MMP7、MMP9蛋白相對表達量的檢測 采用Western blotting法。成功轉(zhuǎn)染細胞后，提取各組細胞總蛋白，將蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑按100∶1混勻后提取各組TPC-1細胞中總蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白變性后按照每個泳道蛋白量30 μg上樣，7.5%SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗FOXQ1(1∶500)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、MMP7(1∶2 000)、MMP9(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)。4 ℃搖床過夜后，0.1%TBST洗膜3次，HR標記二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，0.1% TBST洗膜3次，ECL熒光顯色，用AI600化學發(fā)光成像儀(美國GE公司)成像。采用Image J軟件分析各組條帶灰度值。實驗重復3次。

1.5 各組細胞遷移、侵襲能力的檢測 采用Transwell小室試驗。細胞的遷移能力：轉(zhuǎn)染24 h后，將TPC-1細胞用0.25% 胰酶消化后用不含雙抗的培養(yǎng)基制備成細胞懸液。將細胞懸液200 μL(2×105/mL)均勻接種于Transwell小室的上室內(nèi)，在下室中每孔分別加入10% FBS DMEM培養(yǎng)基600 μL。48 h后，將放置于37 ℃細胞孵箱中的24孔Transwell小室取出。清除上室內(nèi)未穿膜的細胞，用磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，然后將黏附在下室面的細胞用4%多聚甲醛固定30 min，蘇木素染色。在100倍的倒置顯微鏡下，每組隨機選取5個視野，計算各組穿膜的細胞數(shù)。實驗重復3次，計算各組細胞的平均值。細胞的侵襲能力：首先制備Transwell小室，按照1∶3的比例將提前預冷的不含血清DMEM與Matrigel稀釋后，取稀釋液40 μL均勻滴加在Transwell小室的上室面，放置于37 ℃恒溫孵育箱過夜，次日紫外線燈下照射30 min。依照24孔小室檢測細胞的遷移試驗進行其余的步驟。顯微鏡下每組隨機挑選5個視野，計算穿過小室膜的細胞數(shù)，分析侵襲能力的變化。各實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 FOXQ1-siRNA轉(zhuǎn)染TPC-1細胞的干擾效果 無義序列組和實驗組的siRNA轉(zhuǎn)染到TPC-1細胞有綠色熒光蛋白的表達，在48 h時細胞轉(zhuǎn)染率達80%以上。

2.2 各組TPC-1細胞中FOXQ1 mRNA及蛋白的表達比較 空白組、無義序列組、實驗組FOXQ1 mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、0.93±0.04、0.23±0.47；與空白組和無義序列組相比，實驗組FOXQ1 mRNA表達量降低(P均<0.05)；空白組和無義序列組比較，P>0.05?？瞻捉M、無義序列組、實驗組FOXQ1蛋白的相對表達量分別為1.52±0.19、1.48±0.22、0.32±0.03。實驗組FOXQ1蛋白表達量較空白組和無義序列組降低(P均<0.05)，空白組與無義序列組比較，P>0.05。

2.3 各組TPC-1細胞中p-AKT、MMP7、MMP9蛋白的表達比較 實驗組TPC-1細胞中p-AKT、MMP7、MMP9蛋白的相對表達量低于空白組和無義序列組(P均<0.05),空白組與無義序列組比較，P均>0.05。見表1。

表1 各組TPC-1細胞中p-AKT、MMP7、MMP9蛋白的相對表達量比較

2.4 各組TPC-1細胞侵襲、遷移能力比較 遷移試驗結(jié)果：實驗組中穿過Transwell小室膜的TPC-1細胞數(shù)[(19.38±3.86)個/Hp]少于空白組[(68.23±7.38)個/Hp]和無義序列組[(65.12±6.36)個/Hp](P均<0.05)；侵襲試驗結(jié)果：實驗組中穿過Transwell小室膜的TPC-1細胞數(shù)[(15.58±4.89)個/Hp]低于空白組[(48.62±6.28)個/Hp]和無義序列組[(45.38±5.63)個/Hp](P均<0.05)。

3 討論

甲狀腺癌是最常見內(nèi)分泌腫瘤之一，目前已經(jīng)成為女性第五位常見的腫瘤[9]。在甲狀腺癌中，PTC約占80%，好發(fā)于女性和兒童，早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，這是影響PTC患者預后及復發(fā)的關(guān)鍵因素[10]。因此對于PTC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)機制的研究尤為重要。近年研究表明，轉(zhuǎn)錄因子FOXQ1參與多種腫瘤的生物學行為過程[11]。FOXQ1異常表達與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是預測腫瘤疾病預后的關(guān)鍵性因子[12,13]。研究證實，F(xiàn)OXQ1在結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等腫瘤中出現(xiàn)異常表達，其表達水平明顯高于其癌旁正常組織，這種異常表達與腫瘤浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，可能通過調(diào)控血管形成和抗凋亡作用導致腫瘤生長[14～16]。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1在PTC組織中也異常高表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，它可能是調(diào)控PTC發(fā)生及發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子。這些研究提示FOXQ1有可能是PTC分子生物治療靶點的重要基因。siRNA是一種阻斷特定基因的技術(shù)，具有高度的序列特異性，可以特異性地抑制RNA序列，從而極高效率地阻斷目的蛋白的表達水平。本研究通過FOXQ1-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染TPC-1細胞，結(jié)果顯示細胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達的轉(zhuǎn)染效率達到80%以上，實驗組中FOXQ1 mRNA和蛋白的相對表達量低于空白組和無義序列組。

研究表明，在PTC中PI3K/AKT信號通路異常改變，其參與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性的調(diào)節(jié)，與腫瘤浸潤程度及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移存在密切聯(lián)系。MMPs在多種腫瘤中過表達，是腫瘤的惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白。在PTC中MMP7、MMP9均存在高表達，且MMP7蛋白表達水平與腫瘤的大小及淋巴結(jié)的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)；而MMP9的表達量與PTC腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與腫瘤的大小無關(guān)。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促進癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移，敲低FOXQ1在形態(tài)學和分子水平上阻斷TGF-β1誘導的EMT,從而抑制乳腺癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。因此我們進一步探討FOXQ1沉默對TPC-1細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其可能的相關(guān)機制。本研究通過FOXQ1-siRNA沉默TPC-1細胞中FOXQ1基因后，體外侵襲遷移試驗顯示實驗組中細胞的侵襲遷移能力低于空白組和無義序列組，說明FOXQ1是PTC侵襲轉(zhuǎn)遷能力的重要調(diào)控因子。與Zhu等[16]在膀胱癌中siRNA靶向沉默F(xiàn)OXQ1可以通過逆轉(zhuǎn)EMT抑制細胞侵襲遷移能力的研究結(jié)果相一致。進一步探討沉默TPC-1細胞FOXQ1基因后抑制侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)機制，本研究結(jié)果表明實驗組中PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵因子p-AKT，以及與腫瘤的浸潤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的MMP7、MMP9蛋白的相對表達量低于空白組和無義序列組，提示FOXQ1基因可能是通過PI3K/AKT通路影響MMPs表達，從而對PTC的侵襲轉(zhuǎn)移能力進行調(diào)控。

總之，本研究表明FOXQ1-siRAN轉(zhuǎn)染TPC-1細胞可以有效地沉默F(xiàn)OXQ1的表達，并且FOXQ1基因可能通過PI3K/AKT信號通路抑制TPC-1細胞侵襲遷移能力，F(xiàn)OXQ1基因有可能成為PTC患者生物學治療及預后的一個新靶標。但是FOXQ1在PTC中與腫瘤的微循環(huán)、細胞增殖的關(guān)系及相關(guān)細胞信號通路的調(diào)控機制尚有待于進一步研究。

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