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(黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

0 引言

腹瀉是影響仔豬培育生長的重要因素之一，它嚴重影響和制約著仔豬的存活率及養(yǎng)殖者的經(jīng)濟效益[1]。市售治療仔豬腹瀉的藥物很多，但多存在藥物殘留、毒副作用等問題，綠色健康的益生菌制劑已成為研究熱點。我國農(nóng)業(yè)部第1126號公告中允許使用的飼料微生物添加劑有16種。其中益生菌—枯草芽孢桿菌以能夠有效促進動物生長、提高增重、防治動物下痢等作用被廣泛研究應用[2]。本試驗研究了健康仔豬腸道分離的枯草芽孢桿菌體外耐受性，為進一步研制相關(guān)益生菌制劑提供參考。

1 材料與方法

(1)菌株 枯草芽孢桿菌SY-B3 由齊齊哈爾市某豬場仔豬腸道分離獲得。

(2)主要試劑 LB固體培養(yǎng)基(干粉)、LB肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白酶(索萊寶科技有限公司)、豬膽鹽(購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司)。

(3)主要儀器及設備 電熱恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、超凈工作臺(天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn))、恒溫振蕩器(型號為HZQ-FX)，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

(4)制備菌液 用無菌接種環(huán)挑取少量分離保存的枯草芽孢桿菌與LB平板上，劃線，37℃溫箱培養(yǎng)24h，挑取單一菌落，接種到LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至細菌生長的對數(shù)期，平板計數(shù)，菌液濃度為2×108cfu﹒mL-1，待用。

(5)存活率計算 存活率計算公式[3]如下

(6)耐酸性試驗 配制LB肉湯培養(yǎng)基，分為4組，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0按2%的量接種菌液，37℃，180 r·min-1搖床內(nèi)培養(yǎng)，分別于1 h、2 h和3 h取樣0.1 mL進行平板計數(shù)，并計算枯草芽孢桿菌的存活率。

(7)耐膽鹽試驗 取LB肉湯培養(yǎng)基，分別配制含豬膽鹽0.1%、0.3%、0.5%及2%的量接種菌液，37℃，180 r·min-1搖床內(nèi)培養(yǎng)，于2 h、4 h和8 h取樣0.1 mL進行平板計數(shù)，并計算枯草芽孢桿菌的存活率。

(8)耐高溫試驗 將10mL菌液分別至于在70℃、90℃、100℃下水浴，并在3 min、10 min、20 min時間點取樣0.1mL進行平板計數(shù)，計算枯草芽孢桿菌的存活率。

2 結(jié)果

2.1 耐酸性試驗結(jié)果

枯草芽孢桿菌的耐酸性試驗結(jié)果如圖1所示，不同pH的培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時間的延長，枯草芽孢桿菌存活率下降，并且隨著pH值的降低存活率下降明顯；在酸度最高pH 2.0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h的存活率為89.4%，培養(yǎng)3h存活率仍然達到64.7%。

圖1 耐酸性試驗結(jié)果

2.2 耐膽鹽試驗結(jié)果

枯草芽孢桿菌的耐膽鹽試驗結(jié)果如圖2所示，在添加了不同濃度膽鹽的培養(yǎng)基中，其存活率隨濃度增大及培養(yǎng)時間的延長明顯下降，0.3%膽鹽濃度中存活率培養(yǎng)8h后仍在60%以上，但在0.5%膽鹽濃度中培養(yǎng)8h后下降到29.9%。

2.3 耐高溫試驗結(jié)果

如圖3所示，隨著溫度的提高或者孵育時間的延長枯草芽孢桿菌的存活率下降明顯，在70℃條件下孵育有較好的存活率，達到70%以上，但在100℃條件下孵育3min存活率就下降到2.5%，20min后僅為0.2%。

圖2 耐膽鹽試驗結(jié)果

圖3 耐高溫試驗結(jié)果

3 討論

仔豬消化道環(huán)境非常復雜，斷奶后仔豬的消化道環(huán)境比成年健康豬的變化更多。如胃內(nèi)pH值，哺乳仔豬pH 4.0左右，斷奶后5d內(nèi)pH升至5.5～6.0，之后逐漸下降，60日齡后逐步接近成年豬水平(pH=3.0)[4]；消化道中分泌的膽汁能夠抵御外生物對動物的侵害，消化道中膽汁濃度在0.03%～0.3%[3]；本試驗參考周明等[5-8]方法考察分離仔豬腸源枯草芽孢桿菌的耐酸和耐膽鹽能力，結(jié)果表明其具有較強的耐酸性和耐膽鹽能力。

在益生菌制成制劑的過程中很多都需要經(jīng)過高溫(70℃～100℃)處理的過程，所以耐熱性也是考察益生菌的重要指標。本試驗設計枯草芽孢桿菌的耐高溫試驗，在70℃處理20min后仍有較高的存活率，在100℃高溫下存活率較低，結(jié)果表明仔豬腸源枯草芽孢桿菌對高溫有一定耐受性。

通過本試驗發(fā)現(xiàn)，分離的仔豬腸源枯草芽孢桿菌有較強的的抵御仔豬消化道復雜環(huán)境的能力，同時也為進一步研究相關(guān)制劑提供參考。

參考文獻

[1]邱進杰，熊焰，楊智.健康仔豬腸道內(nèi)抗逆性乳酸菌的選育[J].中國獸醫(yī)雜志，2008,44(4):86-87.

[2] 鐘蔚.枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑制備工藝研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2013.

[3] 劉明珠.乳酸糞腸球菌耐受性、抑菌作用及其對瘤胃發(fā)酵功能影響研究[D].南昌：江西農(nóng)業(yè)大學，2013.

[4] 劉宇.豬用乳酸桿菌、雙歧桿菌、納豆芽孢桿菌復合活菌制劑的研制[D].大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學，2008.

[5] 周明，王歡，李澤陽. 豬腸源性枯草芽孢桿菌耐逆性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報,2013, 40(4): 519-522.

[6] Yuyong He, Chunxia Mao, Hong Wen,et al. Influence of ad Libitum Feeding of Piglets With Bacillus Subtilis Fermented Liquid Feed on Gut Flora, Luminal Contents and Health[J]. Scientific Reports , 2017(7):44553.

[7] 周珍文，胡旭初，鄧秋連,等.枯草桿菌芽孢抵抗為腸道環(huán)境的耐性評估[J].熱帶醫(yī)學雜志，2008,8(3)：235-237.

[8] 陳琳，彭虹旎,孔垂斌,等.幾株飼用益生菌對體外模擬胃腸道環(huán)境的抗逆性評估[J]. 中國微生態(tài)學雜志，2010,22(8)：701-704.