馮玉雪,毛 縝,呂蒙蒙

一株DDT降解菌的篩選及其降解特性

馮玉雪,毛 縝*,呂蒙蒙

(中國礦業(yè)大學(xué)(徐州)環(huán)境與測繪學(xué)院,江蘇 徐州 221116)

以DDT為目標污染物,通過篩選獲得了一株效果穩(wěn)定的DDT降解菌,并對其進行形態(tài)學(xué)觀察,生理生化特性及16S rRNA測序鑒定.經(jīng)鑒定,該菌株屬于甲基菌屬(),命名為. XLL03.菌株在pH值為7,溫度30°C,外加碳源濃度0.5%,初始DDT濃度20mg/L時生長量最大.在pH值為6,溫度30℃下,外加碳源(葡萄糖)濃度0.1%,初始DDT濃度20mg/L時對DDT的降解率最大.在優(yōu)化條件下,4d后菌株XLL03對DDT最高降解率可達50.4%.利用GC-MS對DDT的降解中間產(chǎn)物進行定性分析,初步推斷在菌株XLL03中,DDT最初分別通過脫氯和脫氯化氫生成DDD和DDE,隨后DDD和DDE進一步脫氯得到DDMU,最終DDMU開環(huán)后又經(jīng)過一系列反應(yīng)被徹底礦化.在DDT的代謝過程中,未發(fā)現(xiàn)代謝中間產(chǎn)物的積累,表明菌株XLL03在修復(fù)受DDT污染的水或土壤中具有一定的應(yīng)用前景.

DDT；微生物降解；降解特性；降解途徑

DDT(2,2-雙(4-氯苯基)-1,1,1-三氯甲烷)作為一種有機氯農(nóng)藥,被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及控制瘧疾等蟲媒傳播疾病[1-2],從20世紀40年代開始,在全球范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用[3].DDT作為一種典型的持久性污染物,能夠通過食物鏈在人體及動物體內(nèi)的脂肪器官組織中積累,進而致癌、使內(nèi)分泌紊亂并且危害人體的生殖系統(tǒng)[4-6].因此,DDT及其中間產(chǎn)物DDD(2,2-雙(雙氯苯基)-1,1-二氯乙烷),DDE(2,2-雙(對氯苯基)-1,1-二氯乙烯)已經(jīng)被美國環(huán)境保護署列入優(yōu)先污染物[7],一些發(fā)達國家在19世紀70年代就已經(jīng)禁止其使用.雖然我國在1983年也已經(jīng)禁止DDT的使用,但是在我國多地的水[8-12]、土壤[13-18]、空氣[19-20]及食物中都檢測到了一定程度的DDT殘留.

為了解決DDT的環(huán)境殘留問題,國內(nèi)外許多學(xué)者研究并嘗試了很多方法來修復(fù)DDT污染,其中物化方法包括挖掘,焚燒,熱解吸附,表面活性劑洗脫,微波增強熱處理,超臨界液體抽提以及光催化氧化等[21-22].相比較微生物降解,物化方法處理DDT固然是快速,高效的,但在處理過程中極易造成二次污染且費用相對較高,研究發(fā)現(xiàn)在用于土壤修復(fù)時,物化法也會對土壤造成干擾與破壞.而生物修復(fù)技術(shù)對環(huán)境及土壤的干擾要小的多,于是,生物修復(fù)成為了研究重點.

有關(guān)DDT污染的微生物修復(fù),國內(nèi)外研究人員已經(jīng)證實存在一些細菌和真菌能夠有效降解DDT,包括無色桿菌,氣桿菌,芽孢桿菌,梭狀芽胞桿菌,埃希氏菌,假單胞菌,變形桿菌,鏈球菌,黃單胞菌,歐文氏菌,巴斯德梭菌,根瘤土壤桿菌等[23].例如工廠土樣中分離的一株能夠在好氧條件下降解DDT的菌株DH-7[3],10d后能將初始濃度為20mg/L的DDT降解73.6%,在優(yōu)化培養(yǎng)條件后,降解率達到81.4%.此外分離得到的革蘭氏陽性細菌W-1[1]和DB-1[24]對DDT的10d降解率可達67.4% (10mg/L)和83.6% (40mg/L).其中大多數(shù)被篩選出來的DDT降解菌都是在好氧條件下降解DDT菌,如真養(yǎng)產(chǎn)堿菌()[25],但也有細菌,例如反硝化產(chǎn)堿菌() ITRC-4在厭氧和好氧的條件下都能降解DDT[26].這些菌株在培養(yǎng)條件下雖然有著較高的DDT降解率,但是由于或降解周期較長,或濃度較高容易降解,或培養(yǎng)條件較苛刻等原因,在實際應(yīng)用中并不廣泛.

本實驗以農(nóng)田土壤作為原始菌源,旨在馴化篩選出幾株以DDT為唯一碳源且具有高效降解能力的菌株,并選擇其中一株降解效果較好的菌株,對其生長特性以及降解特性進行研究,以此為生物降解法提供高效降解菌菌源.

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑與培養(yǎng)基

本實驗所用藥品為純度不小于98.5%的P,P’-DDT(2,2-雙(4-氯苯基)-1,1,1-三氯乙烷),由德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司生產(chǎn),購于生工生物工程有限公司;色譜級的正己烷購于上海展云化工有限公司,培養(yǎng)基所用試劑及其他化學(xué)試劑均為分析純.

實驗所用4種培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基(NaNO34.0g/L,KH2PO41.5g/L,NaHPO40.5g/L, FeCl3.6H2O 0.0083g/L,CaCl20.01g/L,MgCl20.2g/ L),分離純化培養(yǎng)基(NaNO34.0g/L,KH2PO41.5g/ L,NaHPO40.5g/L,FeCl3×6H2O 0.0083g/L,CaCl20.01g/L,MgCl20.2g/L,蛋白胨1.0g/L,瓊脂 15~ 20g/L),富集培養(yǎng)基(蛋白胨10.0g/L,酵母膏 5.0g/L,NaCl 10.0g/L)和菌種保藏培養(yǎng)基(牛肉膏 3g/L,蛋白胨 10.0g/L,NaCl 5g/L,瓊脂15~20g/L),每種培養(yǎng)基在使用前均調(diào)節(jié)pH值至7.0,121℃滅菌30min.由于DDT是半揮發(fā)性的,所以在培養(yǎng)基滅菌后再添加實驗所需量的DDT.

1.2 DDT降解菌的富集與分離

從徐州市銅山區(qū)西南部農(nóng)田中采集土樣,以此作為微生物富集分離培養(yǎng)的來源.采樣時,選取不同的農(nóng)田,進行多點采樣,以保證菌源的多樣性,采集土樣為地表10cm的土壤.

1.2.1 菌種的富集 取2g原始土樣接入裝有100mL無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中,加入DDT為唯一碳源并使其終濃度為10mg/L.將三角瓶置于恒溫振蕩器中于30℃,180r/min條件下培養(yǎng).按照此方法進行多次轉(zhuǎn)接.經(jīng)過幾十天的富集培養(yǎng)后,培養(yǎng)基中的DDT降解菌大量生長.

1.2.2 菌種的分離與純化 用接種環(huán)沾取最后一次富集培養(yǎng)的培養(yǎng)液,在分離純化培養(yǎng)基上進行劃線,30℃恒溫培養(yǎng)2~3d.待菌株在平板培養(yǎng)基中富集后,通過肉眼觀察,挑取顏色,形態(tài)及大小不同的單菌落于富集培養(yǎng)基中富集2~3d.再以5%的轉(zhuǎn)接量將菌株轉(zhuǎn)接至新鮮的無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6d.按照上面方法,不斷劃線分離直至獲得菌落特征一樣的菌株.

1.2.3 菌株的馴化 本實驗采用逐量分批馴化法進行馴化,選擇多個分離純化出來的菌株進行馴化,用1.2.1的方法逐級提高DDT在無機鹽培養(yǎng)基中的濃度,且每個濃度培養(yǎng)時間至少4d,以保證菌株降解DDT的效果及其穩(wěn)定性.當(dāng)菌株對DDT的降解率基本不變時,停止提高濃度,則該濃度為菌株最大耐受濃度.

1.3 菌種鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 (1)菌落形態(tài)觀察:將獲得的菌株用平板稀釋法涂布于固體培養(yǎng)基上,置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3d,待菌落長出后,從其表面形態(tài),大小,顏色等方面進行觀察并記錄.

(2)掃描電鏡:從平板培養(yǎng)基挑取單菌落并用0.2M PBS清洗菌體1遍,向菌體中加入 2.5%戊二醛并混勻,然后于冰箱中靜置4h;在8000r/min下離心5min,用蒸餾水清洗3次;再分別用梯度濃度酒精脫水;用純乙酸異戊酯置換酒精2次后置于40℃的恒溫干燥箱中烘8h 以上;將干燥好的菌株粉末送至中國礦業(yè)大學(xué)分析測試中心進行掃描電鏡分析,觀察菌株形態(tài)特征.

1.3.2 16S rRNA測序 使用生工生產(chǎn)的SK8255細菌基因組抽提試劑盒來提取菌株的基因組DNA.設(shè)計引物序列為 27F(5’ AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3’),1492R(5’ TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3’),片段長度1500bp.對提取的菌株基因組DNA進行PCR擴增.PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后利用SK8131膠回收試劑盒回收.回收的產(chǎn)物送到上海生物工程服務(wù)有限公司進行16S rRNA序列的測定,并進行序列Blast比對分析,取其近緣菌的16S rRNA 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.3.3 生理生化特性實驗 購買青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的細菌生理生化特性檢測試劑盒,并結(jié)合沈萍等編著的《微生物學(xué)實驗》[27],完成革蘭氏染色實驗,淀粉水解實驗,明膠液化實驗,甲基紅實驗,吲哚實驗,硝酸鹽還原實驗,硫化氫實驗,3%過氧化氫酶實驗,尿素酶實驗,苯丙胺脫氨酶實驗以及葡萄糖發(fā)酵實驗.

1.4 分析測定方法

本實驗采用的細菌計數(shù)法為比色法,即渾濁度計數(shù)法.用移液槍取少量培養(yǎng)物于比色皿中,使用可見分光光度計,與波長600nm處測定其吸光度,記為OD600,以O(shè)D600值來表示細菌的生長量.此過程去除DDT懸濁液的背景值.

取細菌培養(yǎng)液,經(jīng)正己烷萃取后,有機相去除水分,過0.22μm濾膜后,用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)測定DDT含量.采用美國鉑金-埃爾默公司的CLARUS SQ 8型氣質(zhì)聯(lián)用儀.柱子類型為30m*0.25nm*0.25μm的毛細管柱,柱流量為 1.0mL/min;傳輸線和離子源溫度均設(shè)為250°C;離子源電子能量為70eV;進樣口溫度設(shè)為250°C,不分流進樣;柱箱溫度設(shè)定為初始溫度100°C,保持1min,再以20°C /min的速度升溫至150°C然后以5°C /min的速度升溫至260°C,并保持5min;質(zhì)量范圍選取 45~550amu;數(shù)據(jù)采集方式為選擇離子掃描(SIM);溶劑延遲時間為3.5min,整個測試時間為30.5min.

1.5 DDT降解菌的生長及降解特性分析

將在無機鹽培養(yǎng)基中生長至對數(shù)時期的細菌轉(zhuǎn)接5%到新鮮的培養(yǎng)基中,分別考察pH(4, 5, 6, 7, 8, 9),外加碳源(葡萄糖)(0.0%,0.1%,0.3%, 0.5%,1.0%,1.5%),初始濃度(10, 20, 30, 40,50mg/ L)和溫度(10, 20, 30, 35, 40℃)對DDT降解率的影響,進而確定菌株降解DDT的最適降解條件.

測定菌株對DDT降解能力的試驗在最適降解條件下進行,將菌株接種到以20mg/LDDT為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),定時測定DDT殘余濃度,并繪制降解細菌的生長曲線和降解曲線.

1.6 DDT降解菌代謝產(chǎn)物及代謝途徑的分析

將菌株的培養(yǎng)液于冰浴的環(huán)境下置于超聲波細胞破碎儀中進行充分破碎,加入15mL正己烷-丙酮(1:1)超聲20min提取有機物.隨后將提取的有機相置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮,將獲得的有機相定容至5mL,過0.22μm濾膜后用GC/MS分析.本實驗通過GC/MS法測定DDT降解菌的代謝產(chǎn)物,并通過代謝產(chǎn)物分析DDT降解菌對DDT的代謝途徑.GC/MS測試程序同1.4節(jié).

1.7 數(shù)據(jù)處理及表達方式

所有實驗都進行3組重復(fù),每組實驗數(shù)據(jù)測3次求平均值,由origin9.1繪制柱狀圖及折線圖,并將誤差線表示于圖中.

2 結(jié)果與討論

2.1 DDT降解菌的篩選與分離

用以DDT為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基進行菌種的馴化,在DDT濃度為60mg/L的培養(yǎng)基上篩選出一株降解率達到50%以上降解率的菌株,并將其命名為XLL03.菌株XLL03對DDT的耐受極限為60mg/L.

2.2 菌種的鑒定

2.2.1 16S rRNA測序鑒定 菌株XLL03經(jīng)過16S rRNA測序,將序列在NCBI中進行BLAST分析,用Mega 6.06軟件繪制菌株XLL03系統(tǒng)發(fā)育樹.結(jié)果表明菌株XLL03與相似度達到99.79%.

2.2.2 形態(tài)及生理生化鑒定 菌株XLL03在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)后,為乳白色的不透明圓形菌落,質(zhì)地粘稠,邊緣整齊,表面光滑.通過革蘭氏染色后觀察到菌株顏色呈紫色,為革蘭氏陰性菌,在掃描電鏡下的個體形態(tài)為短桿狀,大小在1mm左右.生理生化實驗表明,菌株XLL03具有過氧化氫酶及尿素酶活性,并且可以發(fā)酵葡萄糖以及還原硝酸鹽,但不能液化明膠,分解含硫有機物生成硫化氫,沒有苯丙氨酸脫氨酶.此外,菌株XLL03的甲基紅實驗和吲哚實驗均呈陰性.由此可以看出,菌株XLL03與個體形態(tài)和生理生化特性均具有相似性[26].結(jié)合菌株XLL03與的生理生化特性,初步確定菌株XLL03為甲基菌屬,并將其命名為sp.XLL03.

2.3 DDT降解菌的生長及降解特性

2.3.1 初始pH值對菌株生長及降解能力的影響 如圖1(a)所示:生長量在初始pH值為7左右時達到最大,而最高降解率56.5%則出現(xiàn)在pH值為6左右.由此可以推測菌株XLL03的最適生長初始pH值為7,最適DDT降解初始pH值為6.

圖1 pH值,外加碳源,DDT初始濃度和溫度對菌株XLL03生長及降解能力的影響

2.3.2 外加碳源濃度對菌株的生長及降解能力的影響 如圖1(b)所示,當(dāng)外加碳源濃度為0.5%時生長量最大,因此認為葡萄糖是更加便于細菌利用的碳源,所以會加快細菌的生長繁殖.當(dāng)外加碳源濃度為0.1%時,XLL03對DDT的降解率最大46.6%,降解率隨葡萄糖濃度的增加而降低,可以認為細菌優(yōu)先利用了葡萄糖而對DDT的降解率反而降低.考慮菌株對DDT的降解率,認為0.1%為最佳外加碳源.

2.3.3 DDT初始濃度對菌株的生長及降解能力的影響 菌株的生長及絕對降解量如圖1(c)所示:當(dāng)DDT濃度從10mg/L逐漸增至50mg/L時,菌株XLL03的生長量和絕對降解量都呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢,但菌株生長量在DDT濃度為20mg/L時達到最大值,而絕對降解量在DDT濃度為40mg/L時達到最大值.認為一定濃度的DDT能夠促進菌株的生長量,而濃度大于20mg/L的DDT就會抑制菌株的生長,推測在10~40mg/L的濃度變化中菌株對DDT的耐受性較強,而在濃度達到40mg/L時才會表現(xiàn)出對DDT的降解優(yōu)勢.

2.3.4 溫度對菌株的生長及降解能力的影響 在20~35℃范圍內(nèi),菌株XLL03的生長量和對DDT的降解率都比較好,在30℃時降解率可以達到48.2%(如圖1(d)所示).可以明顯得出,菌株XLL03與大部分細菌一樣嗜中溫,能夠在溫度適宜的條件下進行各項代謝活動.

2.3.5 菌株的生長曲線與DDT降解曲線 通過研究菌株的生長特性和降解特性,將菌株的優(yōu)化條件設(shè)為初始pH 6,初始DDT濃度為20mg/L,外加碳源濃度0.1%,培養(yǎng)溫度30℃.在此條件下將菌株XLL03連續(xù)培養(yǎng)10d,將10d的生長量及DDT殘留量繪制成圖2:可以看出菌株XLL03的生長曲線與細菌的群體生長規(guī)律基本一致,前2d菌株處于延遲期,是對新環(huán)境進行適應(yīng)的過程;在培養(yǎng)的第3d菌株開始快速生長,且在第4d達到最大值,因此這2d對應(yīng)為對數(shù)期,菌株處于最適條件下,生長繁殖很快,相應(yīng)的消耗有機物的速率也較快,對DDT的降解率也在第4d達到最高值50.4%;此后菌株的數(shù)量基本維持平穩(wěn)的狀態(tài),而DDT的剩余量雖略有回升,但基本維持平穩(wěn)的狀態(tài),分析認為除了XLL03的增殖對DDT的降解量增大之外,同時還對DDT有一定的吸附作用,所以之后部分被吸附于菌株表面的DDT又被釋放出來,此階段也即穩(wěn)定期和衰老期,隨著DDT的逐漸耗盡,代謝產(chǎn)物不斷積累,生長條件如pH值,氧化還原電位等條件改變,不利于菌株XLL03的生長繁殖,因此生長曲線基本上為水平曲線,而DDT的剩余量也幾乎不再變化.

圖2 XLL03的生長曲線和DDT降解曲線

2.3.6 DDT代謝產(chǎn)物分析 通過GC/MS得到菌株代謝物的總離子流圖和代謝產(chǎn)物離子特征圖如圖3和圖4所示:可知DDD,DDE以及DDMU都是DDT的初步代謝產(chǎn)物.并且在檢測過程中,未發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物的積累,說明菌株XLL03對DDT的代謝是一個完整的礦化過程.

2.3.7 DDT代謝途徑的初步確定 結(jié)合本實驗的中間產(chǎn)物檢測結(jié)果與現(xiàn)有研究,推測甲基屬菌XLL03對DDT可能的代謝途徑為:

(1)一個氫原子取代脂肪鏈上的一個氯原子將DDT還原脫氯生成DDD,這種代謝方式在微生物Proteus vulgaris 代謝DDT的途徑中出現(xiàn)過,Proteus vulgaris 是最早報道的能夠?qū)DT還原成DDD的微生物之一[28],2003年Ahuja等[26]也提出過在厭氧環(huán)境下DDT會被降解為DDD;接著DDD通過進一步脫氯作用被脫去一個氯原子生成DDMU,這一過程在海洋沉積物的實驗也曾被證明,DDE和DDD在產(chǎn)甲烷和硫代微生物中被脫氯至DDMU[29-30].

(2)DDT脫氯化氫后生成DDE,這一途徑與Thomas[31]和Hay[32]的文章中提到的一致,菌株首先將DDT脫氯化氫生成DDE,再在酶的作用下將苯環(huán)開環(huán)繼續(xù)降解;隨后DDE被脫去氯原子生成DDMU.

圖3 菌株XLL03代謝物的總離子流

圖4 DDT, DDD, DDE和DDMU的離子特征

最終DDMU經(jīng)過一系列反應(yīng)可能被礦化為二氧化碳,而DDT和DDE也可能在加氧酶的作用下被直接開環(huán),再通過一系列反應(yīng)被礦化,大致代謝通路如圖5所示.與本研究得出的結(jié)論類似,一些其他細菌如氣單胞菌()HS01[33],黃金桿菌() PYR2[34],紅球菌()ⅡTR03[35]和惡臭假單胞菌()T5[36]等細菌都能夠在各種媒介中將DDT代謝為DDE和DDMU.此外,Fang等[37]還在宏基因組的基礎(chǔ)上得出包括DDT最初經(jīng)過脫氯作用轉(zhuǎn)化為DDD和DDE,再進一步通過脫氯變?yōu)镈DMU,最后去氧成為DDA后進一步礦化等涉及還原脫氯,氫化,雙加氧,羥基化,脫羧,水解和間位環(huán)裂解反應(yīng)的多步驟過程.而Pan等[38]在基因組功能注釋和質(zhì)譜結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上,將蒼白桿菌() DDT-2降解DDT過程中的每一步機理都用相應(yīng)的基因注釋標注,在基因方面證實了DDT降解途徑的準確性.

圖5 菌株對p,p’-DDT的代謝途徑

3 結(jié)論

3.1 從農(nóng)田土壤中分離到一株能利用DDT作為唯一碳源生長的菌株,經(jīng)鑒定,該菌株屬于甲基菌屬() ,命名為sp. XLL03.

3.2 菌株XLL03在溫度30°C,pH值為7,外加碳源(葡萄糖)濃度0.5%,初始DDT濃度20mg/L時生長量達最大;在溫度30°C,pH值6,外加碳源濃度0.1%,初始DDT濃度20mg/L時對DDT最高降解率可達50.4%.

3.3 利用GC/MS分析代謝產(chǎn)物,推測菌株XLL03在代謝DDT的過程中,最初分別通過脫氯和脫氯化氫將DDT轉(zhuǎn)化為DDD和DDE,隨后DDD和DDE進一步脫氯得到DDMU,最終DDMU開環(huán)后又經(jīng)過一系列反應(yīng)被徹底礦化.

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Screening and degradation characteristics of a DDT-degrading bacteria.

FENG Yu-xue, MAO Zhen*, Lü Meng- meng

(School of Environmental Science and Spatial Informatics, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, China)., 2018,38(5)：1935~1942

DDT was used as the target pollutant, and a strain capable of degrading DDT was obtained by isolation and the identification of the strain was carried out through morphological observation, experiments on physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequencing. The strain was identified as, and named assp. XLL03. The best growing condition for the strain was as follow: pH of 7, 30°C, external carbon source concentration of 0.5% , and initial DDT concentration of 20mg/L. The best degradation condition for the strain was as follow: pH of 6, 30°C, external carbon source(glucose) concentration of 0.1%, and initial DDT concentration of 20mg/L. Under the optimized conditions, the highest degradation rate of DDT by strain XLL03 was 50.4% 4 days later. The qualitative analysis of degradation intermediates of DDT was carried out by GC-MS. It was initially concluded that DDT could first be transformed into DDD and DDE via dechlorination and dehydrochlorination respectively, subsequently both DDD and DDE converted to DDMU by further dechlorination, and then after ring opened, DDMU went through a series of reactions was completely mineralized. No metabolic intermediates was found during the metabolism of DDT, which indicating that strain XLL03 has potential application prospects in repairing DDT-contaminated water or soil.

DDT；biodegradation；degradation characteristics；degradation pathway

X172

A

1000-6923(2018)05-1935-08

2017-09-23

國家自然科學(xué)基金資助項目(51778612)

* 責(zé)任作者, 副教授, mzhen80@163.com

馮玉雪(1993-),女,寧夏中衛(wèi)人,中國礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測繪學(xué)院碩士研究生,主要從事微生物、土壤修復(fù)方面的研究.