周夢玉 宋昕蔚 徐靜 付雪 李婷 朱雨晨 肖幸運 毛一劍 曾大力 胡江 朱麗 任德勇 高振宇 郭龍彪 錢前 吳明國 林建榮 張光恒

水稻是世界主要糧食作物之一，超過一半的人口以稻米為主食[1]。隨著世界人口增加，耕地面積不斷減少，環(huán)境壓力逐漸加大，提高水稻單產成為解決世界糧食安全問題的有效途徑之一。而隨著人們生活水平提高，對稻米品質的要求也越來越高。水稻粒型不僅與水稻產量相關，還與稻米的外觀品質、加工品質、蒸煮和食味品質存在密切的關系[2]。因此，開展粒型性狀QTL研究，對克隆調控水稻粒型性狀關鍵基因、揭示產量構成、探索粒型與稻米品質相關性具有重要的理論意義和應用價值。

迄今為止，國內外的許多研究者們利用不同類型的遺傳群體構建了多種遺傳圖譜。McCouch等[3]利用水稻基因組測序成果，采用電子PCR的方法繪制了一張包含2740個SSR分子標記連鎖圖譜。Xu等[4]利用窄葉青8號與京系17秈粳雜交獲得的永久性DH群體，構建了一個包含108個位點的水稻遺傳圖譜。張啟軍等[5]選用4個測序水稻品種作為作圖親本，兩兩組合，繪制了6張微衛(wèi)星連鎖圖譜。莊杰云等[6]利用24個SSR標記構建了103個水稻主要栽培品種的分子指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。徐建軍[7]以一套用秈稻品種9311為受體、粳稻品種日本晴為供體構建的128個染色體片段代換系為材料，利用多元回歸分析方法，繪制Bin圖譜。作圖群體為F2群體或回交群體時，屬于暫時性群體，只能使用一個有性世代，難以長期維持。相比之下，重組自交系(RIL)群體和加倍單倍體(DH)群體由于遺傳上的純合性，遺傳干擾少，可永久繼代保存，適于進行各種持續(xù)性研究[8]。

遺傳圖譜的構建，為水稻數(shù)量性狀調控基因的定位與克隆提供了便利。研究者們利用各種不同類型的遺傳群體，報道了粒長、粒寬、粒厚和粒重等粒型相關性狀的QTL或基因。其中，粒長QTL達103個，粒寬QTL達95個，粒厚QTL數(shù)量相對較少[9]，另有控制粒重QTL 233個。方先文等[10]以云南省地方秈稻品種苜蓿和江蘇省優(yōu)質粳稻品種南京46為材料，構建了包含202個SSR標記的分子遺傳連鎖圖譜，并研究了RIL群體中粒長、粒寬、籽粒長寬比和粒厚等粒型相關性狀。Xia等[11]為了闡明籽粒形態(tài)的遺傳基礎，利用秈稻品種Jin 23B和圓粳稻品種QingGuAi構建的一個回交群體，共檢測到10個粒型性狀的QTL，其中qGW1、qGS3和qGS7三個對籽粒形態(tài)有較大影響的QTL在兩年內均被檢測到。Zhao等[12]為了解“南陽占”大粒形態(tài)的遺傳基礎，利用南陽占和珍汕97B的重組自交系群體2年內共檢測到53個QTL，分布在11條染色體上。其中，粒寬和粒長的QTL分別在第2和第3染色體上檢測到的頻率最高。Zhou等[13]用蜀恢527作為輪回親本與小粒品種雜交并回交，利用BC2F2群體將控制水稻粒長的主效QTLLk-4(t)作為單個孟德爾因子，定位在第3染色體著絲粒附近遺傳距離為1.4 cM的范圍內。這些粒型主效QTL定位加速推進了水稻籽粒性狀調控基因的挖掘和高產分子育種的進程。目前GL7、srs-3、GS3、GL3.1、GL4、GS5、GW2、qSW5、GW5和Ghd7[14-23]等多個水稻粒型相關主效QTL已被成功克隆,gw3.1、qGL7、qGL7-2、TGW3b和gw9.1[24-28]等也已完成精細定位。但是，由于構建圖譜所使用的群體不同，親本材料遺傳背景存在差異，在基因組覆蓋面、標記疏密程度和具體標記類型等方面均有所不同，其QTL定位結果往往難以直接比較，不利于進一步開展QTL精細定位和基因克隆，這也限制了水稻粒型主效QTL快速、全面的克隆與挖掘。

本研究利用超級稻春優(yōu)84的兩個在遺傳背景上存在較大差異的親本晚粳稻品種春江16B(CJ16B)和廣親和中秈恢復系C84作為群體雜交親本，雜交并連續(xù)自交7代構建衍生的重組自交系作為遺傳作圖群體，篩選含有158個SSR和STS分子標記構建遺傳圖譜。通過對水稻粒型相關性狀進行QTL定位、分析和驗證，進一步挖掘水稻重要農藝性狀的調控基因，完善水稻產量建成調控網絡的分子機制，為水稻新種質資源的篩選鑒定和高產分子設計育種利用奠定材料基礎、提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 群體材料及遺傳圖譜構建

以秈稻恢復系品種C84為父本、粳稻品種春江16B為母本雜交獲得F1，2013年夏從F1代單株上收取自交種，采用單粒傳法連續(xù)自交7代，獲得C84/春江16B重組自交系群體(RIL)，從中選取表型穩(wěn)定的188個株系用于遺傳圖譜的構建。選取在C84和春江16B間呈多態(tài)性，并均勻分布到12條染色體上的69對SSR(simple sequence repeats)和89對STS(sequence tagged site)標記，對188個重組自交系的基因型進行分析鑒定，構建遺傳連鎖圖譜。

1.2 材料種植及農藝性狀調查

親本C84和春江16B及RIL群體，分別于2016年夏和2016年冬，種植在浙江省杭州市中國水稻研究所富陽試驗基地和海南省陵水市中國水稻研究所南繁基地，行株距為20 cm×20 cm,每株系種植4行，每行6株。按照常規(guī)大田管理方法進行管理，并對病蟲草害進行防治。

成熟期對親本C84和春江16B及其188個重組自交系的粒型性狀進行鑒定。挑選灌漿飽滿的籽粒，利用考種儀(萬深SC-G型，杭州萬深檢測科技有限公司)測定粒長、粒寬、千粒重等，每株系3次重復，取平均值[29]。粒厚用游標卡尺測量，每株系8次重復，取平均值。

1.3 遺傳圖譜構建與QTL分析

用MapDraw 2.1進行標記間的連鎖分析，繪制遺傳連鎖圖譜[30]。通過SAS 9.2對雙親和重組自交系群體的粒型性狀進行統(tǒng)計，利用QTLNetwork 2.1進行QTL計算與分析。以P=0.005為閾值統(tǒng)計該標記處是否存在與性狀有關的QTL，采用Kosambi函數(shù)將重組值轉化成遺傳距離。QTL的命名參照McCouch等[31]的命名方式。

1.4 雙親基因克隆序列差異分析及dCAPs分子標記差異位點驗證

對雙親QTL區(qū)間內他人已克隆的6個粒型主效QTL等位基因進行測序，分析其序列差異，根據(jù)編碼區(qū)cDNA差異位點設計dCAP標記驗證。

2 結果與分析

2.1 重組自交系親本C84與春江16B粒型比較

對重組自交系親本C84和春江16B的粒型性狀在兩個環(huán)境條件下進行比較分析，發(fā)現(xiàn)籽粒長度、寬度、厚度、長寬比和千粒重等在杭州和陵水兩個環(huán)境下都存在一定程度的差異，但各性狀變化趨勢和差異程度不盡相同(表1)。C84和春江16B的粒長在杭州分別為8.2 mm和7.4 mm，在陵水為7.8 mm和7.0 mm，兩者均相差0.8 mm，群體親本C84和春江16B粒長在陵水相對杭州略有下降，均減少0.40 mm，降幅分別為4.87%和5.41%，群體株系平均粒長下降了0.18 mm。粒寬的變化趨勢則不一樣，粳稻親本春江16B在兩地沒有差異，均為3.2 mm，而秈稻親本C84的粒寬則陵水比杭州增加0.2 mm，增幅達6.89%，群體株系平均粒寬增加0.11 mm，差異顯著。雙親籽粒厚度差異極顯著，不同環(huán)境變化不大，粒長、粒寬的改變直接影響籽粒長寬比，秈稻親本C84、粳稻親本春江16B和群體株系的長寬比平均值陵水比杭州分別下降了10.71%、4.35%和5.95%。粒型改變往往導致千粒重發(fā)生變化，雖然兩親本在杭州和陵水的千粒重并沒有顯著的差異，但是群體株系的千粒重顯著增加，由杭州的22.17 g增加到陵水的22.98 g，增幅達3.65%。結果顯示，雙親在籽粒形態(tài)上均存在顯著差異，且受環(huán)境影響不大，因此，構建的重組自交系群體可以用于粒型相關性狀的QTL定位。

表1 雙親(C84和春江16B)及其RIL群體2016年在杭州和陵水的粒長、粒寬、粒厚、長寬比及千粒重Table 1.Grain length,width,thickness,length-to-width ratio and 1000-grain weight in C84 and CJ16B and their recombinant inbred line population in Hangzhou,Zhejiang Province and Lingshui,Hainan Province,China in 2016.

2.2 重組自交系群體粒型性狀分布及相關性分析

分別對在杭州、陵水兩個環(huán)境下的雙親及群體粒型性狀進行統(tǒng)計。結果表明，無論是在杭州還是陵水，群體中不同株系粒長、粒寬、粒厚、長寬比及千粒重測定值均表現(xiàn)為連續(xù)分布，且有一定數(shù)量超親株系存在，基本符合正態(tài)分布(圖1)。說明粒型為多基因控制的數(shù)量性狀，符合QTL定位的要求。

圖1 C84/CJ16B重組自交系群體粒型相關性狀分布Fig.1.Frequency distributions of grain shape traits in C84/CJ16B recombinant inbred lines.

表2 C84/CJ16B重組自交系群體粒型性狀間相關性分析Table 2.Correlationship analysis on grain shape traits in C84/CJ16B recombinant inbred lines.

對C84/春江16B重組自交系群體粒型性狀間的相關性進行分析，結果表明同一性狀在不同的環(huán)境中呈極顯著正相關(表2)。杭州與陵水的群體株系的粒長、粒寬和籽粒長寬比等性狀均呈極顯著的正相關，其相關系數(shù)分別為0.809、0.817和0.854；但粒厚及千粒重相對其他粒型性狀在兩地間的相關性較低，相關系數(shù)僅為0.270和0.529。推測這可能與雙親的遺傳背景、群體大小以及杭州、陵水特定環(huán)境中的光照條件存在一定的關系，同時，群體中不同株系對環(huán)境敏感性差異可能會影響籽粒的充實度，造成粒厚及千粒重較大程度分離所致。

2.3 遺傳圖譜的構建

利用均勻分布在水稻12條染色體上的158個SSR和STS多態(tài)標記對RIL群體的188個株系的基因型進行鑒定，構建了總長度為1428.4 cM的遺傳連鎖圖譜，平均每條染色體覆蓋長度為119.03 cM，相鄰分子標記間的平均距離為9.04 cM，平均每條染色體上的標記數(shù)13.2個(表3)。第1染色體及第4染色體上分子標記相對較多，分別達17和18個，第9和第10染色體上分子標記相對較少，分別只有10個和9個。第1染色體平均遺傳距離最大，達11.34 cM，第5染色體平均遺傳距離最小，為7.13 cM。所有標記在染色體上分布較為均勻，但也存在一些間隔較大的區(qū)域(如第3染色體的H3-3－RM1479之間和第12染色體的RM1337－RM3739之間)和標記較為密集的區(qū)域(如第2染色體的H2-3－RM262之間，第4染色體的H4-2－H4-8之間和第5染色體的H5-1－H5-6之間)。整體來看，距離適中，構建的遺傳連鎖圖譜適合進行水稻相關農藝性狀的QTL定位。

表3 本研究所用的標記在水稻12條染色體上分布Table 3.Distribution of the markers used in the study on 12 chromosomes of rice.

2.4 粒型性狀的QTL定位

利用構建的遺傳連鎖圖譜，結合RIL群體188個株系及其親本的粒長、粒寬、粒厚、籽粒長寬比、千粒重等5個粒型性狀在杭州、陵水的表型值，采用復合區(qū)間作圖法，對籽粒形態(tài)進行了QTL分析，共檢測到30個粒型相關QTL(表4、圖2)。其中，粒長QTL 9個，粒寬QTL 5個，粒厚QTL 5個，長寬比QTL 6個和千粒重QTL 5個，單位點貢獻率3.51%～17.25%。

共檢測到9個粒長QTL，貢獻率介于5.75%～14.40%，親本C84及春江16B均有增加粒長的增效等位基因，但來自C84的增效等位基因數(shù)目比來自春江16B的要多，這與親本C84的籽粒長度大于春江16B相符。其中qGL10在兩地均能被檢測到，位于第10染色體上RM6370－RM5689區(qū)間內，杭州和陵水的貢獻率分別為11.97%和10.33%，其增效等位基因均來源于親本C84，該區(qū)間已有粒長調控基因OsPCR1[32]被克隆。qGL1、qGL2.1和qGL2.2，qGL5、qGL11貢獻率均小于10%，其中，qGL2.1區(qū)間內已有粒長調控基因FUWA[33]被克隆，qGL5相應區(qū)間內已有粒長調控基因JMJ703[34]，SRS3/OsKinesin-13A/sar1[35]被克隆。qGL7.1、qGL7.2及qGL12分別解釋粒長10.09%、14.40%、11.04%的遺傳變異。

共檢測到5個粒寬QTL，除qGW1增效等位基因來源于親本C84之外，其余增效等位基因均來源于親本春江16B，且加性效應值較大。qGW2.1和qGW2.2分別在兩地被檢測到，區(qū)間位置相鄰，貢獻率分別為9.58%和9.34%。粒寬QTL中貢獻率最高的是qGW5，其在兩年的試驗中被重復檢測到，位于RM17954－H5-7標記區(qū)間內，貢獻率分別為12.28%和11.44%，該區(qū)間內已有粒寬調控基因qGW5[36]被克隆。qGW1和qGW6貢獻率分別為3.51%和7.06%，尚未見報道，可能是新的QTL位點。

共檢測到5個粒厚QTL。與粒寬相同，除qGT1增效等位基因來源于秈稻親本C84之外，其余增效等位基因均來源于母本春江16B。其中，位于第1染色體上RM8097－RM6703區(qū)間的qGT1在兩地均能被檢測到，杭州和陵水的貢獻率分別為12.75%和12.59%，該區(qū)間與千粒重QTLqTGW1.2重疊，可能受同一基因控制，說明千粒重與粒厚關系密切。qGT2.2定位于第2染色體H2-5－H2-6區(qū)間內，解釋9.51%遺傳變異，該區(qū)間同時定位到qGL2.2及qGLW2.2。qGT2.1、qGT6和qGT9貢獻率均小于10%，至今均尚未見報道，可能是影響籽粒形態(tài)發(fā)育相關的新QTL調控位點。

表4 RILs的粒型相關性狀的QTL定位結果Table 4.QTLs for grain shape-related traits of recombinant inbred lines.

在杭州和陵水分別檢測到了2個和5個控制籽粒長寬比的QTL。其中，qGLW5在杭州和陵水兩地均能被檢測到，貢獻率分別為17.25%及12.75%。qGLW2.1、qGLW2.2及qGLW2增效等位基因均來源于父本C84，位置相鄰，分別解釋籽粒長寬比13.88%、15.61%、12.95%的遺傳變異。qGLW11及qGLW12貢獻率相對較低，分別為7.79%和6.25%，增效等位基因來源于母本春江16B。

共檢測到5個控制千粒重的QTL。位于第5染色體上qTGW5，加性效應值及貢獻率最高，貢獻率達10.55%，其增效等位基因來源于親本C84，能增加千粒重1.2472 g。qTGW1.1和qTGW1.2分別在杭州及陵水兩地被檢測到，位置相近，加性效應及貢獻率也基本一致，其增效等位基因均來源于C84，qTGW1.1區(qū)間內已有千粒重相關調控基因OsTRBF3[36]被克隆。加性效應及貢獻率最低的qTGW9，貢獻率僅為4.55%，增效等位基因來源于C84，能增加千粒重0.8719 g。qTGW4加性效應值為1.1454 g，貢獻率達7.41%。

圖2 水稻粒型相關性狀QTL在染色體上的分布Fig.2.Distribution of QTLs related to grain shape traits in rice chromosome.

利用杭州和陵水兩個群體檢測到的QTL，部分與已報道的QTL相同或相近，部分為首次報道。由于數(shù)量性狀的表現(xiàn)受基因、環(huán)境及其互作的影響，同一性狀在不同的定位群體中表現(xiàn)不一致，且同一群體在不同年份、不同環(huán)境中的表現(xiàn)結果也會有所不同。

2.5 雙親已克隆粒型主效QTL等位基因序列差異分析及分子標記驗證

為了進一步驗證利用春江16B和C84構建的RIL連鎖遺傳圖譜進行QTL定位的可靠性及挖掘重要粒型調控新基因的可能性，我們對定位獲得的粒形主效QTL區(qū)間，比較已克隆基因在雙親中的等位基因序列差異。本研究檢測到的粒型主效QTL區(qū)間內共有6個已知克隆基因，第1染色體上的千粒重調控基因OsTRBF3已被克隆基因，第2染色體上的粒長調控基因FUWA已被克隆，第5染色體上共有3個已知被克隆基因，分別是粒長調控基因SRS3/OsKinesin-13A/sar1，粒寬調控基因qGW5和JMJ703(既調控粒長也調控粒寬性狀)，第10染色體上粒長調控基因OsPCR1為已被克隆基因。分別對雙親已知基因進行克隆測序。表5列出了相關基因外顯子編碼區(qū)序列差異，可見除JMJ703基因在外顯子編碼區(qū)無差異之外，雙親在另外5個基因多個位點都表現(xiàn)出堿基差異，相應位點氨基酸也不同。有兩個位點還由于堿基缺失導致編碼區(qū)翻譯移碼，基因功能發(fā)生變化。我們又根據(jù)雙親目標基因測序的差異位點設計dCAPs標記進行驗證，每個目標基因選取一個差異位點，設計分子標記(表6)，酶切驗證，發(fā)現(xiàn)上述基因對應堿基位點的確存在堿基差異(圖 3)。

表5 雙親(C84和春江16B)已克隆粒型主效QTL等位基因序列差異分析Table 5.Sequence variance analysis of the cloned grain shape main effect QTL allele in the two parents(C84 and CJ16B).

表6 雙親目標基因差異位點dCAPs分子標記引物設計Table 6.dCAPs molecular marker designed according to target gene difference site of the two parents C84 and CJ16B.

圖3 差異位點設計dCAPs分子標記驗證結果Fig.3.Results of dCAPs markers in difference site verifying.

3 討論

水稻籽粒形態(tài)是多途徑、多基因調控的復雜遺傳性狀的綜合體現(xiàn)。本研究通過對杭州和陵水兩個環(huán)境的籽粒性狀比對，同一性狀在不同環(huán)境之間具有較高的相關性，說明粒型性狀總體受環(huán)境影響較小，具較高的遺傳力，但不同性狀受環(huán)境影響存在差異。從表型上看，粒長相對粒寬、粒厚、千粒重更容易受環(huán)境的影響。究其原因可能主要是由群體親本秈粳亞種遺傳背景差異、主效QTL/基因的等位變異以及微效QTL與環(huán)境互作協(xié)同調控的結果。

我們利用C84/春江16B重組自交系群體共定位到的30個與粒型性狀相關QTL，有5個QTL區(qū)間覆蓋了6個已克隆的主效粒型QTL/基因，其中qGL10、qGW5、qGT1和qGL/GW5在兩地中能同時被檢測到，貢獻率均穩(wěn)定在10%以上，分別覆蓋已克隆粒型基因OsPCR1、qGW5和JMJ703(JMJ703同時調控籽粒的長度與寬度的發(fā)育)。其中qGL2.1、qGL7.1、qGW2.1、qGT2.1和qGL/GW2.2是在杭州群體中被檢測到，qGL2.2、qGL7.2、qGW2.2、qGT2.2和qGLW2是在陵水群體中被檢測到的，同一染色體上相應QTL兩個標記位置相鄰、加性效應方向一致、貢獻率也基本相同，我們推測可能是受同一個QTL調控，由于環(huán)境效應導致定位發(fā)生偏離。另外，我們發(fā)現(xiàn)RM17954－H5-7區(qū)間內同時存在粒長、粒寬、長寬比和千粒重的QTL，說明同一區(qū)間中可能存在多個影響籽粒形態(tài)發(fā)育的調控基因，或者存在“一因多效”的可能性。

利用不同材料構建遺傳群體定位的QTL結果往往存在一定的差異。我們定位到的9個調控粒長QTL的區(qū)間中，在3個區(qū)間內已有粒型調控基因克隆，分別為第2染色體上的FUWA，第5染色體上的JMJ703、SRS3/OsKinesin-13A/sar1和第10染色體上的OsPCR1。FUWA在禾本科作物中進化保守，通過限制細胞周期過程，能使籽粒變短、變寬、變厚[33]。JMJ703是水稻中一種活性H3K4特異性去甲基酶，參與控制轉座子的活性，突變體種子長、寬以及厚度都下降[37]。SRS3在發(fā)育的器官中有高表達，影響細胞縱向長度，調控水稻種子長度[38]；OsKinesin-13A通過影響穎殼大小，進而調控水稻穎果大小；sar1突變體的籽粒長度以及其他器官如節(jié)間、葉片以及根部等均變短[35]。OsPCR1主要在水稻幼苗期的根中以及生殖期的第I和II節(jié)間表達，與野生型相比，OsPCR1敲除株系籽粒變輕，粒長變短，粒重下降12%[32]。上述已知克隆基因對水稻粒型均有顯著的調控作用。另有4個粒長QTLqGL-1[39]、qGL2-2[40]、qGL-11[39]和qGL-12[40]等與已報道的水稻粒型基因/QTL區(qū)間有重疊；同樣，5個粒寬QTL定位區(qū)間中，除了qGW1區(qū)段內有1個基因（qGW5/JMJ703）被克隆外，qGW1、qGW6也有重疊區(qū)間的粒寬QTL報道[41,42]；而目前已挖掘的水稻粒厚QTL數(shù)量相對較少，在定位區(qū)間內未發(fā)現(xiàn)與已知粒厚QTL位置重疊。在所有檢測到的千粒重QTL中，除qTGW1.1為檢測到的新位點外，其余4個區(qū)間存在重疊區(qū)段的位點qTGW1-2/qTGW1-3[43]/Kw1-2[44]/tgwt1[45]、qGW-1[46]、gw4[47]、qTGWT-5[48]/gw5b/Gwt5a[49,50]等也已先后被報道。在該區(qū)間內已有編碼單MYB組蛋白家族的端粒重復序列結合因子基因OsTRBF3被克隆，它影響籽粒千粒重[36]。說明千粒重是一個籽粒形態(tài)與稻米胚乳發(fā)育相關的籽粒綜合性狀指標，除了受環(huán)境和遺傳因素影響外，粒長、粒寬、粒厚等形態(tài)性狀發(fā)育與水稻千粒重也密切相關。另外，在我們的定位結果中，除了以上多個已知的粒型相關主效QTL相同或相鄰外，還發(fā)現(xiàn)了多個新的粒型相關QTL調控位點，其中，粒長4個、粒寬3個、粒厚5個及千粒重1個。由此，我們推測不同群體間同一性狀主效QTL定位結果的異同與構建群體的雙親間親緣關系遠近、形態(tài)性狀多態(tài)性、差異等位基因的多寡以及連鎖圖譜的標記數(shù)目存在密切關系。水稻粒型QTL的定位與克隆為發(fā)展分子選擇標記、聚合有利基因及水稻超高產分子設計育種順利實施奠定理論基礎和提供基因新資源。

同時，我們結合C84、春江16B對定位區(qū)間內的5個已知粒型等位基因序列進行分析并根據(jù)差異位點開展分子標記驗證，證實雙親目標等位基因間確實存在編碼氨基酸的差異，我們推測該差異等位基因即為該QTL定位區(qū)間內具粒型調控作用的目標基因。說明利用C84/春江16B構建的重組高代自交系群體可以成功的用于水稻粒型性狀或者其他重要農藝性狀的QTL的定位與挖掘。后期通過雙親全基因組SNPs掃描，加密區(qū)間內的標記數(shù)目，從而飽和該區(qū)段的內的標記數(shù)，以提高不同性狀QTL檢測準確性，加速目標基因的精細定位和圖位克隆。

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