劉 穎，王彥多，曹廣超，施東方，呂迎蘭，王集會(huì)，史 磊*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

天龍Gekko(L.)學(xué)名壁虎，又稱守宮、檐龍。其作為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，性寒味咸，具有祛風(fēng)止痛、通絡(luò)散結(jié)、解毒定驚等作用[1]，歷史悠久?，F(xiàn)今更有研究表明中藥天龍?jiān)诳鼓[瘤、促進(jìn)再生和調(diào)節(jié)免疫力等方面具有藥用價(jià)值[2]，特別是在對(duì)抗惡性腫瘤、結(jié)核病、骨髓炎等疑難雜癥具有藥用價(jià)值和發(fā)展前景[3]。

本實(shí)驗(yàn)采用白僵菌對(duì)中藥天龍粉發(fā)酵，然后對(duì)比發(fā)酵前后天龍水提物與醇提物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制效果，為今后對(duì)中藥天龍的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)耗材

1.1 試劑

蒸餾水；無(wú)水乙醇(鄭州卓利化工產(chǎn)品有限公司)；改良型RP-MI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；胰酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；MTT、DMSO(武漢市蓋云天生物技術(shù)有限公司)；注射用順鉑(20mg/支，批號(hào)：30200896， 齊魯制藥有限公司)。

1.2 儀器

FA1004N十萬(wàn)分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；disb-zc型低溫冷卻循環(huán)水真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；ST 16R高速冷凍離心機(jī)(默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；EL340i型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Molecular Davices)；Memmert CO2培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；100型Nikon 倒置顯微鏡(Japan)。

1.3 藥品

天龍粉(批號(hào)：20150801)；發(fā)酵天龍粉(批號(hào)：20151001)。

1.4 細(xì)胞

肺腺癌A549細(xì)胞株(由山東省立醫(yī)院提供)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1發(fā)酵天龍粉的制備

參照文獻(xiàn)[4]中 2.1項(xiàng)下制備發(fā)酵天龍粉。

2.2 水提物的制備

取發(fā)酵前后天龍粉各0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入15 mL蒸餾水加塞超聲提取20min，抽濾，取濾渣再次置于錐形瓶中，重復(fù)上述操作共3次并將3次濾液合并。按照3000 r/min離心10min，然后置于冷凍干燥機(jī)中制備凍干粉。

2.3 醇提物的制備[5]

取發(fā)酵前后天龍粉各0.5 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL 80%乙醇，80℃水浴回流加熱75min，抽濾，取濾渣再次置于圓底燒瓶中，重復(fù)上述操作并將兩次濾液合并。將濾液置于蒸發(fā)皿中，40℃水浴鍋加熱下蒸干溶劑得到浸膏。

2.4 MTT法體外實(shí)驗(yàn)

2.4.1 配制不同濃度藥物

取2.2項(xiàng)和2.3下的提取物0.0100 g，加入5 mL 1640培養(yǎng)基，配制成藥物濃度為2 mg/mL的稀釋液。在生物安全柜中用0.22 μm的濾膜過濾2次，然后用無(wú)菌1640培養(yǎng)基將稀釋液再次依次稀釋為2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的濃度。

2.4.2 抑瘤實(shí)驗(yàn)

將形態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌A549細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，去除邊緣效應(yīng)并預(yù)留3個(gè)調(diào)零孔，每孔100 uL，放置在培養(yǎng)箱中37℃、5% CO2濃度培養(yǎng)24 h。24 h后取出細(xì)胞板，輕拍細(xì)胞板背面使原有培養(yǎng)液流出，加入2.4.1項(xiàng)下藥物，每個(gè)藥物濃度重復(fù)5個(gè)孔，每孔100 μL；再向另外5個(gè)孔中加入無(wú)血清的1640培養(yǎng)基作為空白組，每孔100 μL；向剩下5個(gè)孔中加入濃度為100 mg/mL的順鉑作為對(duì)照組，每孔100 mL，放入培養(yǎng)箱中相同條件培養(yǎng)24 h。24 h后取出細(xì)胞板避光加入MTT，每孔20 μL，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后取出，將藥物和MTT一并吸出，加入DMSO，每孔100 μL。將細(xì)胞板放入酶標(biāo)儀中于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，按下式計(jì)算抑制率。

3 結(jié)果與分析

3.1 天龍水提物

圖1 發(fā)酵前后天龍水提物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制效果

從圖1中可以看出發(fā)酵前天龍粉水提物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞沒有抑制作用，而發(fā)酵后的天龍粉水提物在藥物濃度為2 mg/mL時(shí)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制率可高達(dá)96.69%。本組實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照順鉑組的抑制率為61.49%，可見發(fā)酵后天龍粉水提物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制效果相比于臨床常用藥順鉑更具有優(yōu)勢(shì)。

3.2 天龍醇提物

圖2 發(fā)酵前后天龍醇提物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制效果

從圖2中可以看出發(fā)酵前天龍粉醇提物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞并沒有抑制作用，反而相當(dāng)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有助于細(xì)胞增殖。而發(fā)酵后天龍粉的醇提物對(duì)乳腺癌A549細(xì)胞具有良好的抑制效果。在藥物濃度為0.5 mg/mL時(shí)即可達(dá)到抑制率90%以上，藥物濃度為2 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到最高為99.14%。本組實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照順鉑組的抑制率為59.38%，可見發(fā)酵后天龍粉醇提物對(duì)肺腺癌A549的抑制效果相比于順鉑也更具優(yōu)勢(shì)。

4 討論與結(jié)論

發(fā)酵是中藥研究領(lǐng)域的一種常用手段，大多應(yīng)用于植物類中藥，而本實(shí)驗(yàn)將蟲類中藥天龍進(jìn)行生物發(fā)酵，具有一定的創(chuàng)新性和研究意義。而且生物發(fā)酵也是中藥炮制與加工的一種方法，許多發(fā)酵后的中藥在臨床研究中也取得良好成果[6]。

白僵菌是一種藥物真菌，它在發(fā)酵過程中通過生物轉(zhuǎn)化會(huì)生成許多或水溶或脂溶性的具有藥理活性的物質(zhì)，例如多肽、多糖、黃酮、萜類化合物等。這些次生代謝產(chǎn)物除了對(duì)人體多個(gè)系統(tǒng)具有防病治病的功能外，還具有抗癌抗炎、抗氧化等作用[7]，因此本實(shí)驗(yàn)采用白僵菌發(fā)酵中藥天龍也是以得到這些次生代謝產(chǎn)物為目的。

本實(shí)驗(yàn)中采用超聲水提法可得到天龍粉中水溶性活性物質(zhì)，如水溶性蛋白、多糖、核酸、維生素等。王穎[8]等人在前期研究中已發(fā)現(xiàn)中藥天龍發(fā)酵后水溶性蛋白與多糖的含量增多，尤其是蛋白質(zhì)含量可達(dá)發(fā)酵前的兩倍?？纱笾峦茰y(cè)發(fā)酵后天龍水提物具有抗癌效果可能與蛋白質(zhì)含量劇增有關(guān)，但實(shí)際情況還需要繼續(xù)分離純化來(lái)驗(yàn)證，目前提供了研究方向。使用80%乙醇對(duì)天龍粉進(jìn)行回流提取時(shí)可使大量的黃酮類物質(zhì)溶出，避免了極性過小的脂溶性大分子物質(zhì)和極性過大的水溶性物質(zhì)溶出對(duì)醇提物的純度進(jìn)行干擾，但仍然難以避免部分水溶物質(zhì)[5]，其水溶部分可今后繼續(xù)研究。

本次實(shí)驗(yàn)證明了白僵菌發(fā)酵后的天龍不論水提物還是醇提物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞都具有良好的抑制效果，相比之下醇提物更具優(yōu)勢(shì)，這為今后中藥天龍對(duì)抗肺腺癌549細(xì)胞株的研究指明了方向。

參考文獻(xiàn)

[1]王 穎,蔡梅超,王立娜,等.天龍粉酶解工藝中最佳用酶的研究[J].中南藥學(xué),2017,15(9):1221-1224.

[2]劉妍婕,吳小東,徐寒梅.壁虎藥用價(jià)值的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展,2015,39(12):915-919.

[3]葉云珍.中藥壁虎的研究進(jìn)展[J].中藥材,2009,32(7):1160-1163.

[4]劉 穎,劉春雨,曹廣超,等.美洲大蠊粉發(fā)酵前后水溶性活性物質(zhì)含量對(duì)比研究[J].化工時(shí)刊,2017(3):1-3,6.

[5]王彥多,劉春雨,呂世潔,等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝[J].食品工業(yè)科技,2017,38(7):183-186,192.

[6]李 津,宋 強(qiáng).藥用真菌發(fā)酵中藥及復(fù)方的可行性分析[J].遼寧中醫(yī)雜志,2014,41(1):48-49.

[7]李 羿,楊 勝,萬(wàn)德光. 藥用真菌液體發(fā)酵研究進(jìn)展及存在問題探討[J].中草藥,2012(10):2066-2070.

[8]王 穎,馬明珠,王立娜,等.發(fā)酵前后天龍粉水溶性活性物質(zhì)含量對(duì)比研究[J].湖南中醫(yī)雜志,2016,32(9):166-168.