甄慶強，張潔，雷震，李猛

(1.萊蕪市人民醫(yī)院 血管外科, 山東 萊蕪 271100;2.鄭州市第八人民醫(yī)院 藥械科, 河南 鄭州 450045;3.河南省中醫(yī)院中心實驗室, 河南 鄭州 450045)

瓜蔞，葫蘆科植物，是一種常見的中藥，性寒、味甘、微苦。主治肺熱咳嗽，痰濁黃稠，胸痹心痛，結(jié)胸痞滿。果實剖開，除去種子和瓜瓤，剩余部分稱為瓜蔞皮?！吨兴幹尽酚涊d瓜蔞皮：“滌痰結(jié)，舒肝郁。治痰熱咳嗽，胸脅作痛”[1]。動脈粥樣硬化是目前發(fā)病率較高的心血管疾病，是冠心病、腦梗死、心肌梗死等的主要病因[2]，如何控制和治療動脈粥樣硬化是近幾年研究的熱點。除高血壓、高血脂、糖尿病、年齡等引起動脈粥樣硬化的傳統(tǒng)因素之外，高同型半胱氨酸血癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的獨立危險因素之一[3]，同型半胱氨酸可通過多種途徑影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，作者主要是研究瓜蔞皮提取物如何影響同型半胱氨酸誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MTT試劑、同型半胱氨酸購自Sigma公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，RT- PCR 試劑盒購自TaKaRa公司，DMEM購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司。蘇木素伊紅HE染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司，瓜蔞皮提取物國藥準字Z20027540，購自上海第一生化藥業(yè)有限公司。

1.2 實驗儀器

智能型全自動生化分析儀，意大利Crony公司；ABI97OO擴增儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；ELx800光吸收酶標儀，美國Biotek公司；X- ZOZB 輪轉(zhuǎn)式病理切片機，上海華巖儀器設(shè)備有限公司；智能型全自動生化分析儀，意大利Crony 公司；TG16- 微量高速臺式離心機，湘儀離心機儀器有限公司；TEC- 2800病理包埋機，意大利 Histo- line 公司。

1.3 動物來源、分組及建模

60只Wistar健康大鼠，雌雄不限，7周齡，體重180～200 g，購于北京生命科學(xué)研究所，在溫度23～25 ℃、相對濕度40%～60%、光照12 h的SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，自由進食及進水。將60只Wistar大鼠隨機分為3組：對照組20只、同型半胱氨酸(Hcy)模型組20只、瓜蔞皮提取物實驗組20只。正常對照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；Hcy模型組在基礎(chǔ)飼料中加入質(zhì)量分數(shù)為1%的蛋氨酸；瓜蔞皮提取物實驗組在1%蛋氨酸飲食同時用瓜蔞皮提取物(2 g·ml-1)按照15 ml·kg-1的量每日灌胃1次，試驗周期為11周[4]。在第11周末給予各組大鼠禁食12 h處理，0.1%的戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉后于大鼠頸動脈處取血液3 ml，然后室溫靜置約0.5 h，3 000 r·min-1離心15 min，取血清后置于-70 ℃環(huán)境下保存待檢測。

1.4 血管平滑肌細胞的分離培養(yǎng)

取血液樣本同時取3組各自Wistar大鼠的胸主動脈，根據(jù)組織貼塊法[5]分離培養(yǎng)血管平滑肌細胞。分離的原代細胞用15%FCS的DMEM培養(yǎng)，細胞傳代后用10%FCS的DMEM培養(yǎng)，實驗用第3～8代細胞。

1.5 細胞增殖實驗

采用MTT比色試驗檢測血管平滑肌細胞增殖，細胞分別在培養(yǎng)至第1、2、3、4、5天時棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，每孔加無血清培養(yǎng)基100 μl和5 g·L-1MTT 10 μl培養(yǎng)2 h，每孔吸取80 μl培養(yǎng)液，加DMSO 100 μl，轉(zhuǎn)入EP管，用DMSO稀釋至310 μl，立即在ELx800光吸收酶標儀吸收波長490 nm下讀取吸光度值，每組重復(fù)測6次(n=6)。

1.6 RT- PCR法檢測細胞中c- myc及c- fos mRNA表達

各組細胞處理24 h后用Trizol試劑提取細胞中RNA,用紫外分光分析和凝膠電泳檢測所提取總RNA 的質(zhì)量和濃度。在逆轉(zhuǎn)錄酶(MLV)催化下合成 cDNA，并進行PCR 擴增。根據(jù)人c- myc、c- fos和β- actin基因的c- DNA序列，按照引物設(shè)計原則用 Primer 5.0 引物設(shè)計軟件設(shè)計引物。 β- actin的上游引物序列為5′- GCC ATG TAC GTA GCC ATC GA- 3′，下游引物序列為5′- GAACCGCTCATTGCCGATAG- 3′；c- myc的上游引物序列為5′- AAACCTCCTCACAGCCCACT- 3′，下游引物序列為5′- TCCAAGACGTTGTGTGTTCG- 3′；c- fos的上游引物序列為5′- TGGACCTGTCTGGTTCCTTC- 3′，下游引物序列為5′- TGTTTAAGCTGTGCCACCTG- 3′。PCR 反應(yīng)體系25 μl，10×Buffer 2.5 μl，探針 probe 1.5 μl，dNTP 0.5 μl，H2O 20 μl，Taq 0.5 μl，進行PCR反應(yīng)；反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，70 ℃ 8 min，4 ℃保存1 h。

1.7 主動脈組織切片的制作

各組大鼠處死后取胸主動脈常規(guī)甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，片厚3～5 μm，HE染色切片，操作步驟按照試劑盒說明書進行，在顯微鏡(×400)下觀察主動脈斑塊情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)指標

對照組和瓜蔞皮提取物實驗組血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、Hcy顯著低于Hcy模型組，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而對照組與瓜蔞皮提取物實驗組血清TC、TG、LDL、Hcy差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 胸主動脈組織病理切片

主動脈組織病理切片用HE染色，對照組主動脈組織內(nèi)膜完整光滑，形態(tài)正常，中膜平滑肌細胞排列整齊，整體未見病理性改變；模型組主動脈管壁結(jié)構(gòu)破壞，有纖維斑塊形成，內(nèi)有大量的泡沫細胞形成，膠原纖維組織增多。實驗組與模型組相比，主動脈內(nèi)膜增厚，管壁不光滑，內(nèi)皮細胞排列紊亂，但是未見纖維斑塊的形成。見圖1。

組 別nHcy/μmol·L-1TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1LDL/mmol·L-1對照組2023．71±1．862．91±0．361．23±0．251．82±0．25模型組2042．69±3．64ab16．90±3．52ab2．94±1．12ab22．12±4．58ab實驗組2027．55±2．365．64±1．751．59±0．233．68±2．37F值11．0414．6010．8812．93P值0．010．010．010．01

a 與對照組比較,P<0.05;b 與實驗組比較,P<0.05

2.3 血管平滑肌細胞增殖的影響

在細胞生長第1天各組無顯著性差異，在第2、3、4、5天對照組與瓜蔞皮提取物實驗組血管平滑肌細胞(VSMC)生長速度無顯著性差異，而Hcy模型組VSMC生長速度顯著大于對照組和瓜蔞皮提取物實驗組(P<0.05)。見圖2。

圖1大鼠主動脈病理組織切片

圖2各組細胞生長速度的比較

2.4 血管平滑肌細胞中c- myc、c- fos基因mRNA的表達

對照組和瓜蔞皮提取物實驗組c- myc和c- fos的表達無明顯差異(P>0.05)，Hcy模型組c- myc和c- fos的表達顯著高于正常組和實驗組(P<0.01)。見表2。

組 別c?mycc?fos對照組0．145±0．00410．158±0．0037模型組0．253±0．0029ab0．372±0．0046ab實驗組0．171±0．00190．160±0．0018F值9．7812．31P值0．00110．0009

a 與對照組比較,P<0.05;b 與實驗組比較,P<0.05

2.5 血管平滑肌細胞中c- myc、c- fos蛋白表達

對照組和瓜蔞皮提取物實驗組c- myc和c- fos的蛋白表達無明顯差異(P>0.05)，Hcy模型組c- myc和c- fos的表達顯著高于對照組和實驗組(P<0.01)。見圖3。

圖3各組細胞中c-myc和c-fos蛋白表達

3 討 論

動脈粥樣硬化是各類心血管疾病的主要病因[6]。近幾年由于人民生活水平的提高，各種心血管疾病的發(fā)病率在逐年提高，研究如何治療動脈粥樣硬化的問題迫在眉睫。導(dǎo)致動脈粥樣硬化的病因較多，Hcy血癥是獨立危險因素之一。Mantjoro等研究發(fā)現(xiàn)男性血清中Hcy的濃度與心- 踝血管指數(shù)有顯著相關(guān)性，血清中Hcy濃度升高可導(dǎo)致動脈血管壁增厚，彈性蛋白斷裂，血壓升高，最終導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[7]。臨床研究顯示高Hcy尿癥的患者易發(fā)生全身性的動脈粥樣硬化和血栓，若體內(nèi)Hcy的濃度進一步升高，患者死于心肌梗死和腦梗死的比例大大提升[8]，提示動脈粥樣硬化的損傷程度與血清中Hcy的濃度有密切關(guān)系[9]。McCully等研究顯示給小鼠喂養(yǎng)高Hcy飲食可導(dǎo)致小鼠全身大、中、小動脈發(fā)生動脈粥樣硬化病變，最終引發(fā)小鼠各臟器(心、腦、脾、肺、腎等)的梗死[10]。本研究通過給大鼠喂養(yǎng)蛋氨酸飲食，成功誘導(dǎo)大鼠高Hcy血癥。Olszewskia研究顯示52 例40～60歲動脈粥樣硬化的患者，其血清中Hcy水平與TG、TC濃度呈正相關(guān)[11]；動脈粥樣硬化患者血清中Hcy的升高還伴有高水平的TG、TC、LDL以及低水平的高密度脂蛋白[12]，與本研究大鼠動脈粥樣硬化模型組血清結(jié)果一致，主動脈組織病理切片進一步證實蛋氨酸飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)動脈粥樣硬化模型成功。瓜蔞皮具有寬胸散結(jié)、清化熱痰，用于治療痰熱咳嗽、心胸悶痛[13]。近幾年研究表明瓜蔞皮提取物可抗炎癥、抗氧化，抑制動脈粥樣硬化的作用。本研究的結(jié)果證實瓜蔞皮提取物可以改善動脈粥樣硬化大鼠的血脂水平及Hcy濃度，并且可以有效地減少動脈粥樣硬化的斑塊，說明瓜蔞皮提取物可有效治療動脈粥樣硬化。

動脈粥樣硬化斑塊形成的必要條件是血管平滑肌細胞過度增殖并向內(nèi)膜移行[14]。平滑肌細胞是動脈中膜的主要成分，根據(jù)其功能不同分為收縮型和合成型兩種表型，在正常生理狀態(tài)下其處于非增生狀態(tài)即收縮型，當(dāng)內(nèi)膜受損時可激活平滑肌細胞內(nèi)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，細胞由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，開始迅速增殖生成泡沫細胞，最終形成動脈粥樣硬化斑塊[15]。本研究中當(dāng)用Hcy處理大鼠血管平滑肌時，細胞增殖速度顯著高于對照組，證實高濃度Hcy可刺激平滑肌細胞增殖，瓜蔞皮提取物可以抑制Hcy引起的細胞增殖。說明瓜蔞皮提取物抑制了動脈粥樣硬化的必要步驟。瓜蔞皮如何抑制高Hcy引起的細胞增殖？之前研究證明，c- myc、c- fos等基因是動脈損傷之后的早期應(yīng)答基因[16]。c- myc蛋白是獲能因子，是DNA合成所必需的成分[17]；c- fos蛋白是一種反式調(diào)節(jié)蛋白。兩種蛋白可進入細胞核內(nèi)促進相關(guān)SMC基因開放，產(chǎn)生大量生長因子，促進SMC增殖[18]。 本研究證實，高Hcy可以促進平滑肌細胞c- myc、c- fos基因的表達，從而引起平滑肌細胞增殖。瓜蔞皮提取物可以抑制高Hcy引起的 c- myc、c- fos基因的表達增加，從而抑制其引起的細胞增殖。

綜上所述，瓜蔞皮提取物可以抑制動脈粥樣硬化的血脂水平，抑制高Hcy引起的血管平滑肌細胞的增殖，抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，這為動脈粥樣硬化的治療藥物篩選提供新的思路。

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