顧興偉，周家華

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210009)

胰腺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展過程受到多種編碼基因與非編碼基因的調(diào)控[1]。MicroRNA(miRNAs)是一類小片段(20～22個(gè)核苷酸)的非編碼RNA，miRNA的表達(dá)失衡對(duì)胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有重要影響[2- 3]。miRNA- 200c屬于miRNA- 200家族，具有調(diào)控腫瘤侵襲的作用[4- 5]。已有研究表明，miR- 200c在胰腺癌組織中表達(dá)降低[6]。并且胰腺癌干細(xì)胞中miR- 200c的表達(dá)降低，而miR- 200c過表達(dá)能夠抑制胰腺癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲[7]。然而關(guān)于miR- 200c是否參與調(diào)控胰腺癌細(xì)胞侵襲及機(jī)制仍然有待進(jìn)一步研究。本研究以胰腺癌細(xì)胞SW1990和PANC- 1為研究對(duì)象，旨在探討miR- 200c過表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲的影響，為胰腺癌的防治提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人胰腺癌細(xì)胞SW1990、PANC- 1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，常規(guī)傳代培養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清及胰酶購自Gibco公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Lipofectamine2000、Trizol及PCR擴(kuò)增試劑盒購自Invitrogen公司；SYBR green PCR mix購自TaKaRa公司；miR- 200c引物、U6引物、miR- 200c類似物(miR- 200c mimics)及其陰性對(duì)照(Scramble)購自GenePharma公司；PMSF、RIPA裂解液購自碧云天公司；Matrigel購自BD公司；Super ECL Plus試劑盒、BCA試劑盒購自Pierce公司；AHNAK兔抗人多克隆抗體(sc- 98373)、β- actin兔抗人多克隆抗體(sc- 130656)購自Santa Cruz Biotechnology公司；pmirGLO載體、Dual- luciferase檢測(cè)試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入合適體積的人胰腺癌細(xì)胞SW1990和PANC- 1，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度更換新鮮培養(yǎng)基或傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將以1×105對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人胰腺癌細(xì)胞SW 1990及PANC- 1接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)密度至60%～70%時(shí)，根據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Lipofectamine2000說明書分別轉(zhuǎn)染miR- 200c mimics及其陰性對(duì)照。

1.2.3 RNA提取及RT- PCR 使用Trizol從細(xì)胞中分離提取出總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用SYBR green PCR mix在StepOne實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行RT- PCR。miR- 200c和U6擴(kuò)增引物購買自GenePharma公司，其中U6為內(nèi)參對(duì)照，各組相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 按照試劑盒的說明書要求，使用8 μm孔徑的室評(píng)估細(xì)胞遷移。在Transwell上室中加入100 μl Matrigel，2 h凝固后將含有105個(gè)細(xì)胞的200 μl無血清DMEM培養(yǎng)基加入Transwell上室中，將含10%FBS的200 μl DMEM培養(yǎng)基加入到下室中。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2中孵育。培養(yǎng)24 h后用棉簽刮去Transwell上室內(nèi)的細(xì)胞，固定并用0.1%結(jié)晶紫染色遷移至膜底部的細(xì)胞，通過顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.5 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR- 200c靶基因 采用TargetScan、PicTar和miranda數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR- 200c的靶基因，使用miranda數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)靶基因AHNAK的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)與miR- 200c的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建靶基因AHNAK的3′UTR(野生型3′UTR)與miR- 200c的結(jié)合位點(diǎn)突變的序列(突變型3′UTR)。AHNAK的野生型或突變型3′UTR亞克隆至pmirGLO載體中，構(gòu)建pmirGLO- AHNAK- wt和pmirGLO- AHNAK- mut。實(shí)驗(yàn)分為4組：(1)Scramble和pmirGLO- AHNAK- wt；(2)Scramble和pmirGLO- AHNAK- mut；(3)miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- wt；(4)miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- mut。在SW1990及PANC- 1細(xì)胞中，按照上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。按照Dual- luciferase試劑盒說明書檢測(cè)螢火蟲和海腎熒光素酶活性，海腎螢光素酶活性作為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.7 蛋白免疫印跡檢測(cè) 用含有PMSF的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，利用BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%的脫脂牛奶封閉。膜與AHNAK或β- actin抗體4 ℃孵育過夜，再使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗與膜室溫孵育1 h。使用Super ECL Plus試劑盒進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，其中β- actin為內(nèi)參對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA- 200c的表達(dá)

RT- PCR結(jié)果顯示，在SW1990與PANC- 1細(xì)胞中，相比轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR- 200c mimics 24 h后miR- 200c的表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

*與對(duì)照組比較，P<0.05

圖1RT-PCR檢測(cè)SW1990與PANC-1細(xì)胞中miR-200c的相對(duì)表達(dá)量

Fig1RelativeexpressionofmiR-200cinSW1990andPANC-1cellswasdetectedbyRT-PCRassay

2.2 miR- 200c過表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲的影響

Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比人胰腺癌細(xì)胞株SW1990及PANC- 1過表達(dá)miR- 200c后SW1990與PANC- 1細(xì)胞的侵襲能力顯著減弱(圖2)。

圖2miR-200c過表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞SW1990及PANC-1侵襲的影響

Fig2EffectsofmiR-200coverexpressiononinvasioninSW1990andPANC-1pancreaticcancercells

2.3 AHNAK是miR- 200c的靶標(biāo)

生物信息學(xué)結(jié)果顯示，miR- 200c可特異結(jié)合AHNAK 3′UTR區(qū)域，結(jié)合位點(diǎn)如圖3A所示。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與Scramble和pmirGLO- AHNAK- wt共轉(zhuǎn)染相比，miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- wt共轉(zhuǎn)染至SW1990和PANC- 1細(xì)胞，熒光素酶活性顯著降低。但是，與Scramble和pmirGLO- AHNAK- mut共轉(zhuǎn)染相比，miR- 200c mimics和pmirGLO- AHNAK- mut共轉(zhuǎn)染至SW1990和PANC- 1細(xì)胞，熒光素酶活性基本不變(圖3B)。上述結(jié)果表明，miR- 200c能夠與AHNAK基因的3′UTR結(jié)合。

2.4 miR- 200c過表達(dá)對(duì)AHNAK蛋白表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，在人胰腺癌細(xì)胞SW1990和PANC- 1中，與對(duì)照組相比過表達(dá)miR- 200c能夠顯著抑制AHNAK的蛋白表達(dá)(圖4)。

*與對(duì)照組比較，P<0.05

圖3miR-200c能夠與AHNAK基因的3′UTR區(qū)結(jié)合

Fig3MiR-200cspecificallybindsAHNAK3′UTR

圖4miR-200c過表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞SW1990和PANC-1中AHNAK蛋白表達(dá)的影響

Fig4EffectsofmiR-200coverexpressiononAHNAKproteinexpressioninSW1990andPANC-1cells

3 討 論

胰腺癌是美國男性和女性癌癥死亡的第4大常見原因[8]。盡管臨床醫(yī)師和科學(xué)家在不斷地努力，但胰腺癌患者5年生存率仍較低[9]。在2000年至2011年期間，中國男性胰腺癌發(fā)病率逐年上升[10]。胰腺癌惡性程度高，在發(fā)病早期極易發(fā)生局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使得傳統(tǒng)手術(shù)、放療以及化療的療效差[11]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA通過與其靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)相互作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在生物體內(nèi)起到致癌或者抑癌作用[12]。比如，miR- 451通過靶向調(diào)節(jié)CAB39促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[13]，發(fā)現(xiàn)miR- 1271通過靶向調(diào)節(jié)ZEB1和TWIST1抑制胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。

鈣調(diào)蛋白AHNAK亦稱橋粒聯(lián)結(jié)蛋白(desmoyokin)，在多種細(xì)胞類型中表達(dá)[15]。最近的證據(jù)表明，AHNAK具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的能力[16]。AHNAK能夠促進(jìn)偽足形成、細(xì)胞遷移和侵襲、增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白活性、誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[17]。在間皮瘤細(xì)胞中，降低AHNAK的表達(dá)能顯著降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力[18]。以上研究成果均表明，AHNAK在腫瘤的遷移與侵襲中發(fā)揮著重要的作用。

miR- 200是一類抑制腫瘤的miRNA家族，其包括miR- 200a、miR- 200b、miR- 200c、miR- 141和miR- 429，并參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[19]。miR- 200c作為miR- 200家族的重要成員之一，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。miR- 200c可以通過靶向調(diào)節(jié)Bmi- 1和E2F3抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[20]，而miR- 200c通過靶向調(diào)節(jié)FN1能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[21- 22]。我們研究結(jié)果顯示，在人胰腺癌SW1990和PANC- 1細(xì)胞中過表達(dá)miR- 200c顯著降低胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力，并且miR- 200c能夠與AHNAK的3′UTR結(jié)合并下調(diào)AHNAK的蛋白表達(dá)水平。綜上所述，miR- 200c過表達(dá)可通過靶向調(diào)節(jié)AHNAK的蛋白表達(dá)而抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲。

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