黎妮，黃巧，賈琳，劉昌璇，黃娟，李永霞，陳文莉

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院 腎病內(nèi)科，湖北 武漢 430000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病較為常見的嚴重并發(fā)癥，也是臨床上終末期腎臟疾病發(fā)生的重要原因之一。早期臨床表現(xiàn)為患者出現(xiàn)微量蛋白尿，隨后進展為蛋白尿惡化，腎小球濾過率降低等，導致腎功能缺失[1- 2]。足細胞作為蛋白濾過的最后屏障，其細胞損傷導致的功能異常也成為蛋白尿產(chǎn)生的原因之一，是DN的致病因素之一[3]。這提示，保護足細胞有望成為治療DN發(fā)生的重要手段。高血糖是引起糖尿病腎損傷的主要因素，能夠產(chǎn)生氧化應激，增加晚期糖基化終產(chǎn)物和活性氧(reactive oxygen species，ROS)，加重腎損傷[4]。番茄紅素(lycopene，Lyc)是西紅柿等植物富含的天然色素，具有較強的抗氧化和抗自由基作用，還具有抗炎、抗腫瘤等作用[5- 6]。有研究顯示，Lyc能夠改善糖尿病大鼠的DN進展[4]。盡管如此，Lyc在DN中的保護作用及其機制研究還較少。本研究主要通過檢測Lyc對高糖下小鼠足細胞的影響，探討Lyc對高糖誘導小鼠足細胞損傷的保護作用及可能機制。

1 實驗材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

小鼠永生系腎足細胞(MPC5)購自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；RPMI- 1640培養(yǎng)基(Gibco，31800022)；胎牛血清(BioInd，04- 001- 1ACS)；IFN- γ(Sigma，14777)；MTT檢測試劑盒(Bioswamp，M1020)；ROS檢測試劑盒(碧云天，S0033)；葡萄糖(Sigma，G8270)，甘露醇(Sigma- Aldrich，M4125)；Lyc(Sigma- Aldrich，PHR1770)；抑制劑LY294002(Selleck，S1105)；流式細胞儀(Beckman)；全自動化學發(fā)光分析儀(上海天能)。GAPDH(CST，97166)；Nephrin(Abcam，ab136894)；Podocin(Abcam，ab181143)；LC3(Abcam，ab48394)；PI3K(Abcam，ab86714)；p- PI3K(Abcam，ab182651)；Beclin 1(Abcam，ab217179)；Pan- AKT(Abcam，ab8805)；p- Pan- AKT(Abcam，ab38449)；Rabbit IgG(Biosharp，BL003A)；mouse IgG(Biosharp，BL001A)。

1.2 MPC5的細胞培養(yǎng)

依據(jù)參考文獻[7]報道方式復蘇和培養(yǎng)MPC5，采用含有10%胎牛血清(FBS)和γ干擾素(IFN- γ)的RPMI- 1640培養(yǎng)基復蘇細胞，置于33 ℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱進行增殖培養(yǎng)。待細胞融合度達80%～90%時進行細胞傳代，并更換為不含有IFN- γ的培養(yǎng)基(含5%FBS)，細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行分化培養(yǎng)10～14 d。在正式實驗開始之前須進行同步化處理，具體操作為更換細胞培養(yǎng)基為不含IFN- γ的培養(yǎng)基(2%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT法檢測細胞增殖活性

選取狀態(tài)良好的MPC5，接種1×104個細胞·孔-1于96孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。依據(jù)實驗分組進行細胞干預處理48 h：正常糖組(Control組)補充5.5 mmol·L-1葡萄糖；高滲組(HP組)補充5.5 mmol·L-1葡萄糖和19.5 mmol·L-1甘露醇；高糖組(HG組)補充25 mmol·L-1葡萄糖；高糖+低劑量Lyc組(HG+L- Lyc組)補充25 mmol·L-1葡萄糖+3.125 μmol·L-1Lyc；高糖+中劑量Lyc組(HG+M- Lyc組)補充25 mmol·L-1葡萄糖+6.25 μmol·L-1Lyc；高糖+高劑量Lyc組(HG+H- Lyc組)補充25 mmol·L-1葡萄糖+12.5 μmol·L-1Lyc。細胞處理結(jié)束后每孔加入20 μl 5 mg·ml-1MTT溶液，小心混勻后繼續(xù)細胞培養(yǎng)4 h。采用2 000 r·min-1離心10 min，去掉細胞培養(yǎng)孔內(nèi)上清后加入150 μl DMSO，振蕩混勻后測定540 nm波長處吸光度OD值。

1.4 ROS檢測

依據(jù)MTT檢測的細胞活性篩選Lyc使用劑量后，細胞分為Control、HP、HG和HG+H- Lyc組4組。細胞經(jīng)不同處理結(jié)束后更換為含有10 μmol·L-1ROS探針工作液(DCFH- DA)的無血清培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育30 min。收集細胞培養(yǎng)液、清洗液以及單細胞懸液，800×g離心5 min后去掉上清，加入PBS清洗細胞2次后加入適量PBS重懸細胞，采用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)熒光強度。

1.5 Western blot檢測蛋白表達水平

為探究Lyc對胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)信號通路的影響，采用PI3K抑制劑LY294002處理細胞，此時細胞分為Control、HP、HG、HG+H- Lyc以及HG+H- Lyc+LY組5組，其中HG+H- Lyc+LY組細胞采用高糖和Lyc處理的同時加入20 μmol·L-1LY294002處理48 h，其他各組細胞經(jīng)葡萄糖和(或)甘露醇以及Lyc干預處理48 h。收集細胞沉淀，提取細胞總蛋白,取20 μg總蛋白進行SDS- PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。采用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜后采用一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后繼續(xù)使用二抗稀釋液室溫孵育1 h，TBST洗膜后使用化學發(fā)光試劑顯色，全自動化學發(fā)光分析儀檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 Lyc提高高糖狀態(tài)下MPC5的細胞活性

MTT檢測各組MPC5的細胞活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HP組細胞活性與Control組無顯著性差異，表明高滲對細胞活性的影響不大，即排除高滲對細胞活性的影響。與Control組比較，HG組細胞活性顯著下降(P<0.001)；與HG組比較，HG+M- Lyc組和HG+H- Lyc組細胞活性明顯升高(P<0.05)，且隨劑量的增加而升高。表明Lyc可提高高糖下MPC5的活性，且具有劑量依賴性。因此，后續(xù)實驗將采用高劑量Lyc(12.5 μmol·L-1)進行細胞處理。見圖1。

2.2 Lyc減少高糖狀態(tài)下MPC5的ROS含量

高血糖能夠誘導腎臟氧化應激反應，而Lyc是一種強有效的抗氧化劑，能夠有效降低氧化應激反應。ROS含量檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組比較HG組胞內(nèi)ROS含量顯著升高(P<0.001)，與HG組比較HG+H- Lyc組細胞ROS含量明顯下調(diào)(P<0.05)。表明高糖誘導MPC5細胞產(chǎn)生嚴重的氧化應激損傷，而Lyc能夠有效清除這種情況下產(chǎn)生的ROS。見圖2。

2.3 Lyc通過PI3K信號通路改善高糖狀態(tài)下MPC5的損傷

組間比較，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001

圖1Lyc對高糖狀態(tài)下MPC5活性的影響

Fig1EffectofLyconthecellviabilityofMPC5inhighglucosestate

Podocin和Nephrin是MPC5功能相關(guān)的重要標志蛋白。與Control組比較，HG組Podicin和Nephrin顯著下降(P<0.05)。Lyc處理后Podicin和Nephrin較HG組顯著回升(均P<0.05)；采用LY294002處理后與HG+H- Lyc組比較，HG+H- Lyc+LY組兩種蛋白的表達均顯著下調(diào)(均P<0.05)。這表明Lyc能夠改善高糖誘導的足細胞損傷，且這種改善作用與PI3K信號通路有關(guān)。見圖3。

2.4 Lyc通過PI3K/AKT信號通路增強自噬

各組足細胞的自噬相關(guān)蛋白檢測發(fā)現(xiàn)(圖4)，HG組足細胞LC3B- Ⅱ和Beclin 1表達水平高于Control組(P<0.05)；Lyc處理后足細胞中LC3B- Ⅱ和Beclin 1的表達水平較HG組顯著增加(P<0.05)。表明Lyc增強高糖誘導的足細胞自噬。此外，HG組p- AKT和p- PI3K蛋白水平較Control組有所升高；HG+H- Lyc組中p- AKT和p- PI3K表達水平則較Control組和HG組顯著升高(P<0.05)。LY294002處理后p- PI3K和p- AKT表達均顯著下調(diào)，細胞的自噬相關(guān)蛋白表達也減少，與HG+H- Lyc存在顯著差異(P<0.05)。表明Lyc通過PI3K/AKT信號通路增強了高糖誘導的細胞自噬。

3 討 論

足細胞作為腎小球濾過膜的重要組分細胞之一，其細胞形態(tài)、功能受損和數(shù)量減少均能導致該屏障功能異常，成為腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因素[8]。特異性表達蛋白Nephrin和支架蛋白Podocin蛋白是足細胞損傷的重要標志[8- 9]，均對足細胞裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)和功能維持發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖處理下MPC5的Podocin和Nephrin均較對照組顯著下降，提示高糖環(huán)境下MPC5細胞功能受損。

A．為流式細胞術(shù)檢測各組MPC5細胞內(nèi)ROS含量水平；B.為圖A中ROS含量的定量圖(**P<0.01；***P<0.001)

圖2Lyc減少高糖狀態(tài)下MPC5的ROS含量

Fig2LycreducedtheROScontentofMPC5inhighglucosestate

A.為Western blot檢測各組足細胞的Podicin和Nephrin蛋白表達水平；B.為圖A的定量圖(與Control比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05；與HG+H- Lyc組比較，&P<0.05)

圖3Lyc通過PI3K信號通路減輕高糖誘導的MPC5損傷

Fig3LycrelievedthedamageofMPC5inducedbyhighglucosethroughPI3Ksignalingpathway

氧化應激反應對腎組織造成的損傷也是DN的重要發(fā)病機制之一，同時也是造成足細胞損傷的重要原因。有研究顯示，高糖環(huán)境下小鼠足細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，細胞增殖能力受到抑制[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，采用高糖處理MPC5后細胞內(nèi)ROS含量顯著升高，且細胞活性也顯著下降，與前人研究結(jié)果一致。因此在DN發(fā)展中，有效緩解機體和細胞內(nèi)氧化應激反應將有助于改善足細胞損傷和DN的發(fā)展。

A.為Western blot檢測各組足細胞的自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin 1以及PI3K/AKT通路蛋白表達水平；B、C.為圖A的定量圖(與Control組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05；與HG+H- Lyc組比較，&P<0.05)

圖4Lyc通過PI3K/AKT信號通路增強自噬

Fig4LycenhancedautophagythroughPI3K/AKTsignalingpathway

足細胞高度分化，增殖能力有限，足細胞損傷可直接導致蛋白尿的產(chǎn)生[11]。細胞自噬在足細胞分化和細胞損傷修復過程中發(fā)揮重要的作用。有研究顯示，糖尿病大鼠足細胞自噬體數(shù)量較正常大鼠足細胞增加，體積增大[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腎足細胞中自噬蛋白LC3表達升高，而大鼠腎足細胞自噬抑制模型中腎足細胞對致?lián)p刺激更為敏感，細胞功能下降，嚴重導致足細胞損傷，最終表現(xiàn)為蛋白尿的產(chǎn)生[13- 14]。本研究采用高糖處理MPC5，自噬相關(guān)蛋白表達較對照組同樣有所增加。這些數(shù)據(jù)均顯示足細胞存在一定的自噬活性，其自噬的發(fā)生可抑制足細胞的損傷，是一種保護機制，能夠維持足細胞的穩(wěn)態(tài)和功能。

Lyc是西紅柿等植物中富含的羥類胡蘿卜素，是強有效的抗氧化劑。已有研究發(fā)現(xiàn)，Lyc可通過改善氧化狀態(tài)和調(diào)節(jié)p- AKT水平改善糖尿病大鼠功能，緩解糖尿病大鼠腎病的進展[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，Lyc增加高糖環(huán)境下MPC5中Podocin和Nephrin蛋白表達，降低細胞ROS含量，同時增加細胞自噬相關(guān)蛋白表達。PI3K/AKT信號通路是生物體內(nèi)最為重要的信號通路之一，參與調(diào)控多項生命活動，涉及細胞增殖、凋亡、自噬等等。本研究結(jié)果顯示，Lyc增加高糖環(huán)境下MPC5細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白表達，而使用LY294002處理后細胞損傷有所加劇，而LC3- Ⅱ和Beclin 1則有所降低。這表明Lyc能夠降低高糖狀態(tài)下小鼠腎足細胞的ROS含量，同時增強細胞的自噬活性，進而改善高糖誘導的小鼠腎足細胞損傷，這一作用機制可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

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