陶善東，宋立孝，陳月，丁邦和，周立濤，何正梅，王春玲，李玉峰，于亮,2

(1.南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院 血液科，江蘇 淮安 223300； 2.南京醫(yī)科大學 血液病重點實驗室，江蘇 南京 210029)

急性淋巴細胞白血病(ALL)是一類起源于造血干細胞，以原始、幼稚淋巴細胞異常增生為主，抑制正常造血、侵犯淋巴組織及各種髓外器官的惡性克隆性疾病。目前，盡管化療能夠治愈部分ALL，但成人ALL的長期生存率和治愈率遠低于急性非淋巴細胞白血病(ANLL)及兒童ALL，高復發(fā)率、復發(fā)后再誘導緩解率低成為影響ALL療效的關(guān)鍵因素，復發(fā)難治性ALL預后極差，且目前尚無標準挽救治療方案可遵循，化療聯(lián)合新藥組成方案成為治療復發(fā)難治性ALL的新策略[1]。

硼替佐米是一種可逆性蛋白酶體抑制劑，通過選擇性地與蛋白酶體活性位點的蘇氨酸結(jié)合，可逆性抑制哺乳動物細胞中蛋白酶體26S亞單位的糜蛋白酶、胰蛋白酶活性。研究證實，在多種腫瘤細胞中硼替佐米能有效抑制NFκB的活性，從而抑制與細胞增殖相關(guān)基因的表達，亦可增加化療藥物的敏感性，最終導致腫瘤細胞的凋亡。目前，硼替佐米已被FDA批準用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤及復發(fā)的非霍奇金淋巴瘤。近期研究發(fā)現(xiàn)，硼替佐米在復發(fā)或難治性Ph+(費城染色體陽性)ALL及T細胞ALL的治療中取得了一定的療效[2- 3]，但目前硼替佐米聯(lián)合化療在成人復發(fā)難治性ALL中的作用研究較少，本研究應用硼替佐米聯(lián)合化療治療4例復發(fā)難治性ALL并觀察其療效。

1 資料與方法

1.1 病例資料

病例1，男性，35歲，因“雙下肢疼痛2 d，發(fā)現(xiàn)白細胞增高1 d”入院。血常規(guī)：白細胞計數(shù)203×109L-1，血紅蛋白128 g·L-1，血小板計數(shù)91×109L-1；骨髓形態(tài)：增生明顯活躍，原始、幼稚淋巴細胞70%；免疫分型：CD19、CD10、CD34、HLA- DR陽性；基因篩查：陰性；染色體核型：46，XY。DOCP+DA誘導化療后達完全緩解(CR)，先后予DOAP、米托蒽醌+中劑量阿糖胞苷、柔紅霉素+中劑量阿糖胞苷、大劑量MTX+LSP、MA方案鞏固化療5個療程，復查骨髓形態(tài)提示復發(fā)，查BCR- ABL融合基因(p190)陽性，予HAOP再誘導未緩解。

病例2，女性，25歲，因“牙齦增生1個月，發(fā)現(xiàn)白細胞增高1 d”入院。血常規(guī)：白細胞計數(shù)96.4×109L-1、血紅蛋白107.00 g·L-1、血小板計數(shù)74×109L-1；骨髓形態(tài)：有核細胞增生明顯活躍，原始、幼稚淋巴細胞占0.62；免疫分型：cCD79a、CD10、CD13、CD19、CD34、HLA- DR陽性；基因篩查及突變檢測：BCR- ABL融合基因(p190)陽性、EVI1陽性；染色體核型：46，XX(分裂相少)。予伊馬替尼+DOCLP誘導化療第14天復查骨髓提示CR，先后予伊馬替尼+IDOCP、柔紅霉素+中劑量阿糖胞苷、大劑量MTX、MA、DOCLP鞏固化療5個療程。復查骨髓：原始、幼稚淋巴細胞共占0.195，提示復發(fā)，予ID+VCP、Hyper- CVAD A方案、Hyper CVAD B方案+伊馬替尼再誘導均未緩解。

病例3，男性，31歲，確診CML13年，予羥基脲、高三尖杉酯堿、干擾素等維持治療5年一直處于慢性期，5年后復查骨髓提示急髓變，先后予TA、HAD、MA、DA聯(lián)合伊馬替尼、達希納口服維持治療7年，查血常規(guī)：白細胞計數(shù)59.54×109L-1、血紅蛋白71.00 g·L-1、血小板計數(shù)21×109L-1；骨髓：有核細胞增生活躍，原始、幼稚細胞為0.945，CML急淋變；免疫分型：CD10、CD19、CD22、CD34、TDT、HLA- DR陽性；融合基因：BCR/ABL P210陽性；ABL激酶突變：F359V突變；染色體核型：46,XY，t(9；22)(q34；q11)。先后予DOP、COMEP、Hyper CVAD A方案誘導化療均未緩解。

病例4，女性，16歲，因“發(fā)熱伴全身乏力5 d”入院。血常規(guī)：白細胞計數(shù)421.79×109L-1，血紅蛋白41 g·L-1，血小板計數(shù)37×109L-1；骨髓形態(tài)：增生極度活躍，原始、幼稚淋巴細胞0.41，細胞POX染色陰性；免疫分型：CD19、CD10、CD34、HLA- DA、cCD79a陽性；基因篩查及突變檢測：陰性；染色體核型：46,XX，add(3)(p26)，-16，del(22)(q11)，+mar。先后予DOCP、COMEP、Hyper- CVAD B方案、克羅拉濱、IDOCP誘導化療均未達CR。

4例復發(fā)難治性ALL患者均來自淮安第一醫(yī)院2012年至2016年住院患者，其中男2例，女2例，中位年齡28歲；2例為BCR- ABL融合基因陽性ALL(其中1例為后期演變的BCR- ABL融合基因陽性)，1例為慢性髓系白血病(CML)急淋變，1例染色體復雜異常，患者的具體臨床特征見表1。

表14例復發(fā)難治性ALL患者臨床特征

Tab1ClinicalcharacteristicsinfourpatientswithrelapsedandrefractoryALL

病例性別年齡/歲染色體核型基因異常疾病狀態(tài)1男3546，XYBCR?ABL復發(fā)2女2546，XXBCR?ABL復發(fā)3男3146，XY，t(9；22)(q34；q11)EVI1難治4女1646，XX，add(3)(p26)，?16，del(22)(q11)，+marBCR?ABL無難治

1.2 治療方法

硼替佐米聯(lián)合DOLP方案(硼替佐米1.3 mg·m-2第1、4、8、11天，柔紅霉素60 mg·m-2第1至第3天，長春新堿2 mg第1、8、15、22天，門冬酰胺酶2 000 IU·m-2第2、8、15、21天，地塞米松10 mg第1至第14天)與硼替佐米聯(lián)合COMEP方案(環(huán)磷酰胺750 mg·m-2第1、3天，米托蒽醌4 mg第1至第4天，地塞米松10 mg第1至第14天，依托泊苷0.1 g第1至4天，長春新堿2 mg第1、8、15、22天)治療。

1.3 療效評估

比較患者硼替佐米治療前后血常規(guī)、骨髓細胞形態(tài)、融合基因及細胞遺傳學特征，并留取患者不同病期骨髓標本，采用Ficoll密度梯度離心法分離出單個核細胞，分裝至1.5 ml EP管內(nèi)(每管細胞數(shù)約1×106個)保存于-80 ℃低溫冰箱，Western blot檢測NFκB- p65蛋白的表達與活性分析患者治療效果。

2 結(jié) 果

2.1 患者治療前后分子生物學及細胞遺傳學等特征

患者復發(fā)后出現(xiàn)分子生物學異常改變，1例患者復發(fā)前p210陰性，復發(fā)后轉(zhuǎn)為陽性，1例CML急淋變患者復發(fā)后出現(xiàn)ABL激酶區(qū)F359V突變，1例患者合并BCR/ABL、EVI1融合基因雙陽性，其相關(guān)免疫表型及細胞數(shù)見表2。

表24例復發(fā)難治性ALL患者治療前后細胞學及分子學特征

Tab2MorphologyandmoleculescharacteristicsinfourcasesofrelapsedandrefractoryALLbeforeandafterchemotherapy

病例白細胞數(shù)/L-1原始細胞/%免疫表型染色體核型11?1#22?2#33#44#203×1094．03×1096．14×10996．4×1096．17×1091．42×10959．54×1091．50×109421．8×1092．14×10970202．58819194．5204162CD10/CD19CD10/CD19MRD(<1×10-4)CD10/CD19/CD79a/CD13CD10/CD19/CD79a/CD13MRD(<1×10-4)CD10/CD19/CD22/CD34CD10/CD19/CD22/CD34CD10/CD19/CD79aCD10/CD19/CD79a46，XY46，XY46，XY46，XX46，XX46，XX46，XY，t(9；22)(q34；q11)46，XY，t(9；22)(q34；q11)46，XX，add(3)(p26)，?16，del(22)(q11)，+mar46，XX，add(3)(p26)，?16，del(22)(q11)，+mar

注：1、2、3、4分別表示4例患者初診時，1*、2*表示2例患者復發(fā)時，1#、2#、3#、4#表示4例患者復發(fā)化療后

2.2 患者治療前后NFκB蛋白的表達與活性

為了進一步探討硼替佐米用于復發(fā)難治性ALL治療的可行性，檢測了上述4例患者不同病期骨髓單個核細胞中NFκB蛋白的表達與活性，結(jié)果顯示同一患者復發(fā)期或硼替佐米治療前表達與活性均較高，硼替佐米治療后表達與活性較前下降。見圖1。

Western blot檢測4例ALL患者硼替佐米治療前后骨髓單個核細胞中NFκB- p65蛋白的表達與活性，1、2、3、4分別表示4例患者治療前，1#、2#、3#、4#表示4例患者治療后

圖1復發(fā)難治性ALL患者治療前后NFκB蛋白的表達與活性測定

Fig1DetectionofNFκBexpressionandactivityinpatientswithrelapsedandrefractoryALLaftertreatment

2.3 4例患者硼替佐米治療后療效觀察

4例復發(fā)難治性ALL患者，3例使用硼替佐米聯(lián)合DOLP方案化療，1例聯(lián)合COMEP方案化療，3例硼替佐米聯(lián)合DOLP方案化療的患者中2例1個療程達到CR，但短期內(nèi)復發(fā)，1例1個療程達到部分緩解(PR)，1例硼替佐米聯(lián)合COMEP方案化療的患者未緩解。見表3。

表34例復發(fā)難治性ALL患者療效觀察

Tab3Curativeeffectof4relapsedandrefractoryALLpatients

病例化療方案療程短期療效觀察長期療效觀察1硼替佐米+DOLP1CR復發(fā)2硼替佐米+DOLP1CR復發(fā)3硼替佐米+DOLP1PR未緩解4硼替佐米+COMEP1未緩解未緩解

3 討 論

ALL是一類以骨髓中原始、幼稚淋巴細胞惡性克隆性增殖為特征，雖然有多種不同的治療方案用于ALL，但復發(fā)率高、總體生存率低仍然是成人ALL治療過程中面臨的難題。最近國內(nèi)報道1例難治性ALL經(jīng)13個月的治療才獲得初次緩解[4]，表明復發(fā)難治性ALL的治療仍存在諸多困難。目前，復發(fā)難治性ALL療效差，新的治療方案仍處于不斷探索中。硼替佐米作為蛋白酶體抑制劑，目前已被FDA批準用于成人多發(fā)性骨髓瘤及復發(fā)非霍奇金淋巴瘤的治療，且在成人ALL的臨床試驗中亦取得了一定的療效[5- 6]。既往的研究表明，在復發(fā)難治性急性髓系白血病(AML)及兒童復發(fā)ALL患者中，應用硼替佐米聯(lián)合化療可使得部分患者獲得CR，尤其在兒童復發(fā)ALL緩解率更高[7- 8]。因此，硼替佐米可能成為復發(fā)難治性ALL的一種新的選擇。

泛素化- 蛋白酶體途徑是蛋白質(zhì)降解的最重要的細胞內(nèi)途徑，參與蛋白質(zhì)降解、細胞轉(zhuǎn)錄、DNA修復、細胞周期調(diào)控及應激反應等多種生理過程，泛素化- 蛋白酶體途徑是轉(zhuǎn)錄調(diào)控必需的，NFκB是關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其活化受蛋白酶體介導的抑制蛋白IκB的調(diào)控，NFκB在多種實體瘤及血液腫瘤細胞中持續(xù)活化，活化的NFκB具有抗凋亡活性，抑制NFκB可以誘導腫瘤細胞凋亡[9]，提示蛋白酶體抑制劑在腫瘤治療中起重要作用。作為可逆性蛋白酶體抑制劑，在多種腫瘤細胞中硼替佐米能抑制與細胞增殖相關(guān)基因的表達，增加化療藥物的敏感性，最終導致腫瘤細胞的凋亡，但目前硼替佐米聯(lián)合化療應用于成人復發(fā)難治性ALL治療的相關(guān)報道較少。本研究中首先檢測了4例復發(fā)難治性ALL患者骨髓單個核細胞中NFκB的表達與活性，發(fā)現(xiàn)復發(fā)期或難治性患者NFκB的表達與活性均較高，同時應用硼替佐米聯(lián)合化療治療上述4例患者，治療后再次檢測NFκB的表達與活性，較治療前明顯下降。

本研究應用硼替佐米聯(lián)合DOLP或COMEP方案治療4例復發(fā)難治性ALL患者，硼替佐米均以1.3 mg·m-2分別應用于第1、4、8、11天，對于Ph染色體陽性ALL患者化療過程中聯(lián)合靶向藥物伊馬替尼，化療過程中骨髓抑制期部分患者并發(fā)呼吸道感染、敗血癥，未發(fā)生明顯心臟毒性及神經(jīng)毒性，治療結(jié)束后通過觀察患者白血病癥狀消失與否，復查血常規(guī)、骨髓形態(tài)等指標進一步評估療效，3例硼替佐米聯(lián)合DOLP方案化療的患者中2例1個療程獲得CR，1例1個療程達到PR，1例硼替佐米聯(lián)合COMEP方案化療的患者未緩解。結(jié)合既往的研究及本研究結(jié)果，硼替佐米聯(lián)合化療在復發(fā)難治性ALL的治療中具有一定的療效，提示硼替佐米可增加傳統(tǒng)化療藥物對白血病細胞的敏感性，其分子機制可能與Notch1、NFκB、PI3K/AKT信號通路相關(guān)[10- 11]。研究表明，在AML中NFκB持續(xù)活化，硼替佐米通過抑制NFκB活性增強AML細胞對化療藥物的敏感性[12]，而在ALL體外細胞研究中發(fā)現(xiàn)抑制NFκB并不能增強白血病細胞對化療藥物敏感性[13]。在ALL患者體內(nèi)，硼替佐米抗白血病細胞的機制是否是通過抑制NFκB實現(xiàn)尚不完全明確，本研究中應用硼替佐米治療前后，分別檢測患者骨髓單個核細胞中NFκB的表達與活性，發(fā)現(xiàn)治療前復發(fā)期ALL患者NFκB表達增強，且呈持續(xù)活化狀態(tài)，治療后表達下降、活性減低，與既往研究結(jié)果[14]一致。

硼替佐米抗腫瘤細胞的確切分子機制仍不明確，但在復發(fā)難治性ALL患者中具有一定療效，硼替佐米聯(lián)合化療或靶向治療藥物仍是復發(fā)難治性ALL患者新的選擇[15]，獲得緩解后應盡早行異基因造血干細胞移植。

[參考文獻]

[1] ZHAO J,WANG C,SONG Y,et al.Treatment of refractory/relapsed adult acute lymphoblastic leukemia with bortezomib- based chemotherapy[J].Int J Gen Med,2015,12(8):211- 214.

[2] DEWAR R,CHEN S T,YECKES- RODIN H,et al.Bortezomib treatment causes remission in a Ph+ALL patient and reveals FoxO as a theranostic marker[J].Cancer Biol Ther,2011,11(6):552- 558.

[3] HU X,XU J,SUN A,et al.Successful T- cell acute lymphoblastic leukemia treatment with proteasome inhibitor bortezomib based on evaluation of nuclear factor- κB activity[J].Leuk Lymphoma,2011,52(12):2393- 2395.

[4] 朱文艷,王志清,華海應.急性淋巴細胞性白血病13個月后初次緩解1例并文獻復習[J].現(xiàn)代醫(yī)學,2015,43(9):1163- 1164.

[5] KANE R C,BROSS P F,FARRELL A T,et al.Velcade:U.S. FDA approval for the treatment of multiple myeloma progressing on prior therapy[J].Oncologist,2003,8(6):508- 513.

[6] HOUGHTON P J,MORTON C L,KOLB E A,et al.Initial testing (stage 1) of the proteasome inhibitor bortezomib by the pediatric preclinical testing program[J].Pediatr Blood Cancer,2008,50(1):37- 45.

[7] WALKER A R,KLISOVIC R B,GARZON R,et al.Phase Ⅰ study of azacitidine and bortezomib in adults with relapsed or refractory acute myeloid leukemia[J].Leuk Lymphoma,2014,55(6):1304- 1308.

[8] MESSINGER Y H,GAYNON P S,SPOSTO R,et al.Bortezomib with chemotherapy is highly active in advanced B- precursor acute lymphoblastic leukemia:therapeutic advances in childhood leukemia & lymphoma (TACL) study[J].Blood,2012,120(2):285- 290.

[9] CORTES J,THOMAS D,KOLLER C,et al.Phase I study of bortezomib in refractory or relapsed acute leukemias[J].Clin Cancer Res,2004,10(10):3371- 3376.

[10] KOYAMA D,KIKUCHI J,HIRAOKA N,et al.Proteasome inhibitors exert cytotoxicity and increase chemosensitivity via transcriptional repression of Notch1 in T- cell acute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia,2014,28(6):1216- 1226.

[11] BASTIAN L,HOF J,PFAU M,et al.Synergistic activity of bortezomib and HDACi in preclinical models of B- cell precursor acute lymphoblastic leukemia via modulation of p53,PI3K/AKT,and NF- κB[J].Clin Cancer Res,2013,19(6):1445- 1457.

[12] ROMANO M F,PETRELLA A,BISOGNI R,et al.Effect of NF- kappaB/Rel inhibition on spontaneous vs chemotherapy- induced apoptosis in AML and normal cord blood CD34+ cells[J].Leukemia,2003,17(6):1190- 1192.

[13] MIN D J,MOSKOWITZ N P,BROWNSTEIN C,et al.Diverse pathways mediate chemotherapy- induced cell death in acute lymphoblastic leukemia cell lines[J].Apoptosis,2006,11(11):1977- 1986.

[14] 徐晶晶,胡曉慧,沈雅穎,等.一例難治性急性T淋巴細胞白血病硼替佐米聯(lián)合化療治療臨床分析[J].中華血液學雜志,2011,32(10):697- 698.

[15] WANG Z,ZHU S,ZHANG G,et al.Inhibition of autophagy enhances the anticancer activity of bortezomib in B- cell acute lymphoblastic leukemia cells[J].Am J Cancer Res,2015,5(2):639- 650.