李仁斌 余光書 林焱斌

脊髓損傷 (spinal cord injury，SCI) 是嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，損傷后原有的血－脊髓屏障破壞，血管基膜裂解，微血管損傷，產(chǎn)生出血、水腫、炎癥等病變，損傷患者多伴有下肢感覺和運動功能減退或消失[1-3]。目前，SCI 尚未有理想的治療方法?；|金屬蛋白酶組織抑制因子 (tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2) 作為一種內源性的酶類能夠抑制細胞外基質 (extracellular matrix，ECM)的降解從而維持組織內環(huán)境的穩(wěn)定[4]，故對 SCI 后組織修復所需環(huán)境的調控至關重要。I 型膠原蛋白(Collagen I) 主要來自哺乳動物成纖維細胞、軟骨細胞等。研究表明[5]，Collagen I 在損傷后傷口愈合，

血管重建中發(fā)揮重要作用；IV 型膠原蛋白 (Collagen IV) 由血管內皮細胞分泌，在正常的神經(jīng)系統(tǒng)中，存在于腦脊液和微血管周圍，起組織連接作用[6-7]。

研究表明[8]，SCI 后 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 在某個時間內的表達持續(xù)升高，有利于損傷處血管的構建，基膜的重塑及軸突的生長，對 SCI 后肢體運動功能的恢復起重要作用。但三者在 SCI 后表達的變化趨勢尚不清楚。本研究旨在觀察大鼠 SCI后 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 的表達情況，探討 TIMP-2，Collagen I 和 Collagen IV 對 SCI 模型大鼠肢體運動功能恢復所起的作用。

材料和方法

一、實驗材料

1. 實驗動物：60 只體重為 (220±20) g 的健康成年雌性 SD 大鼠，購于上海斯萊克實驗動物責任有限公司，許可證號碼為 SCXK (滬) 2014-006，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心 SPF 級實驗室。本研究符合福建中藥大學動物實驗倫理委員會要求。

2. 實驗試劑：(1) 一抗：兔抗鼠 TIMP-2 抗體(Abcam，美國)、兔抗鼠 Collagen I 抗體 (Abcam，美國)、兔抗鼠 Collagen IV 抗體 (Abcam，美國)；(2) 二抗：山羊抗兔 Alexa flour488 熒光二抗(Thermo Fisher，美國)；(3) 尼氏染色試劑盒 (索萊寶、北京)、免疫組化試劑盒 (邁新，福州)。

3. 實驗儀器：NYU 脊髓打擊器 (W. M. Keck 神經(jīng)科學協(xié)作中心，美國)、顯微鏡 (Leica DMI 4000B /DFC425C，德國)、Image-lab 圖像分析系統(tǒng)、Image-Pro 圖像分析系統(tǒng) (BIORADHERCULES，美國)。

二、實驗方法

1. 動物分組和造模：采用隨機數(shù)表法將 60 只SD 大鼠隨機分為假手術組、術后 3 天組、術后5 天組、術后 7 天組和術后 9 天組，每組 12 只。假手術組僅行椎板切除術，不損傷脊髓。其余各組均使用 NYU 脊髓打擊器建立 SCI 模型[9]。大鼠麻醉成功后，取 T9～11區(qū)域進行脫毛，局部皮膚消毒，沿脊柱縱軸作一長約 2～3 cm 切口，依次切開皮膚、皮下組織、肌肉、筋膜，鈍性剝離附著于棘突兩側的肌肉，暴露 T9～11椎骨棘突和椎板，咬除棘突和椎板，暴露 T10部位白色脊髓硬脊膜，將大鼠固定于NYU 打擊器固定臺，調整打擊桿，使其瞄準 T10脊髓正中，調整打擊桿高度為 12.5 mm，釋放打擊桿，使其自由下落撞擊脊髓，出現(xiàn)大鼠尾部劇烈擺動，頭部肌肉瞬間收縮，術后出現(xiàn)雙下肢完全癱瘓，提示造模成功。造模成功后，生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合。術后每天早晚人工按摩膀胱和下腹以助大鼠排便排尿，每天進行青霉素 4 萬單位 / 只前肢注射，連續(xù) 3 天，預防感染。

2. 行為學評分：本實驗采用 BBB 肢體運動功能評分[10]評估假手術組大鼠和術后 9 天組大鼠肢體運動功能。由 2 名非本實驗工作人員且熟練掌握 BBB評分標準的專業(yè)人員于造模后 1 天、3 天、5 天、7 天、9 天對每只大鼠獨立進行 BBB 肢體運動功能評分，每只大鼠評分 2 次，且每次觀察時間 ≥3 min。最終取平均評分。

3. 取材方法：水合氯醛麻醉成功后，將每組中的 6 只大鼠腹腔剪開，取血，止血鉗夾住腹主動脈，打開胸腔，暴露心臟，然后于右心房、左心耳處各剪一小口，自左心尖部注入 150 ml 生理鹽水快速沖洗，然后緩慢注入 150 ml 的 4% 多聚甲醛進行灌注固定，待大鼠肢體僵硬后以脊髓損傷處為中心，取長約 2 cm 脊髓段，置于 4% 多聚甲醛，4 ℃固定 48 h。每組剩余 6 只大鼠麻醉成功后，迅速以脊髓損傷處為中心，取長約 2 cm 脊髓段，放置于EP 管中，迅速放入液氮速凍，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

4. 檢測方法：(1) 尼式染色：將厚度 5 μm 的石蠟切片常規(guī)脫蠟入水后放入尼氏染色液，置于 60 ℃溫箱中浸染 50 min，蒸餾水迅速沖洗 3 遍，再用分色液分色 1～2 min (具體時間根據(jù)分色情況而定)，晾干，中性樹膠封片，鏡下觀察，采集圖片。(2)免疫組化染色：采用免疫組化試劑盒染色，具體步驟如下：酒精梯度脫蠟，純水漂洗 1 min，微波枸櫞酸鈉抗原修復，放置常溫中冷卻至室溫。PBS 漂洗3 次，每次 3 min。洗去 PBS，加入過氧化物酶阻斷劑室溫下孵育 10 min，PBS 洗 3 次，每次 3 min，除去 PBS，加入非免疫動物血清封閉 10 min，不洗，加入一抗 4 ℃ 孵育過夜。次日常溫下復溫 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 3 min，加入二抗室溫孵育10 min，除去 PBS，加入鏈霉菌抗生物素－過氧化物酶溶液，室溫下孵育 10 min，除去 PBS 液，DAB顯色，顯色時間根據(jù)光學顯微鏡下觀察而定，自來水終止顯色，蘇木素復染 1 min，自來水返藍 30 s，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂透明封片。在光學顯微鏡下用低倍鏡先定位，再用高倍鏡觀察。每個指標每個區(qū)域選擇 6 個不重疊視野進行統(tǒng)計。(3) Western blot 檢測：取 1 cm 脊髓剪碎，加裂解液，冰浴 60 min。14 000 g 離心 10 min，BCA法定量蛋白。各孔加入 200 μl BCA 工作液，于 37 ℃烤箱中放置 30 min。在酶標儀中測得標準曲線和吸光度，通過其算出蛋白濃度。蛋白變性后，將樣品于相應濃度的 SDS-PAGE 凝膠電泳分離，待 Marker蛋白跑至玻璃板底部且樣本蛋白基本呈一條直線沉于底部，則停止跑膠。轉至 PVDF 膜封閉，TPBS 洗3 次。封閉液封閉 1.5 h，先后加入一抗二抗，每次步驟間隔均用 TBST 漂洗。用 TBST 清洗去除二抗后開始顯影。將膜置于化學發(fā)光試劑中反應 1 min，在避光條件下顯影，凝膠掃描成像系統(tǒng)進行分析。分別采用 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 與 β-actin的吸光度比值表示蛋白的相對表達量。

三、統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)采用± s 表示，符合正態(tài)分布的用t檢驗或單因素方差分析，非正態(tài)分布資料用秩和檢驗。BBB 評分不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗；免疫組化和 Western blot 檢驗符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析進行比較。

結 果

一、BBB 肢體運動功能評分

與假手術組相比，術后 9 天組 BBB 肢體運動功能評分顯著下降。隨著損傷后時間的推移，術后 9 天組的 BBB 肢體運動功能評分逐漸升高，與術后 1 天相比，術后 7 天和術后 9 天的大鼠肢體 BBB 運動功能評分升高，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05) (表1)。

表1 術后 BBB 評分 (± s)Tab.1 BBB score after surgery (± s)

表1 術后 BBB 評分 (± s)Tab.1 BBB score after surgery (± s)

注：與術后 1 天組相比，aP＜0.01Notice: Compared with the scores 1 day postoperatively, aP < 0.01

組別 n 術后 1 天 術后 3 天 術后 5 天 術后 7 天 術后 9 天假手術組 12 19.50±0.32 19.84±0.21 20.23±0.26 21.00±0.00 21.00±0.00術后 9 天組 12 0.58±0.15 0.83±0.21a 2.33±0.31a 4.42±0.38a 10.08±0.50a F 值 0.31 6.56 9.58 13.95 P 值 0.58 0.18 0.01 0.001

二、尼式染色

假手術組神經(jīng)細胞結構完整、形態(tài)規(guī)則，呈飽滿的梭形狀，胞質內可見清晰的虎斑樣尼氏體，尼氏體飽滿，細胞核明顯；SCI 各組神經(jīng)細胞損傷嚴重，局部可見瘀血斑塊，細胞水腫或碎裂，無細胞核，尼氏體萎縮或較小，神經(jīng)細胞周圍可見空泡樣變，術后 9 天神經(jīng)細胞形態(tài)有所改善，尼氏體較飽滿，細胞水腫減輕 (圖1)。

三、免疫組化染色

免疫組化結果發(fā)現(xiàn)假手術組未見明顯的 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表達。SCI 后 3 天即出現(xiàn) TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 的表達且表達量逐漸上升。TIMP-2 表達部位主要在神經(jīng)元、膠質細胞、單核細胞；Collagen I 和 Collagen IV 彌散性表達于脊髓實質的基質成分中。SCI 各組的 TIMP-2 表達均高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)；SCI 后 5 天 TIMP-2 表達最高，與其它時間點相比差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)；SCI 各組的 Collagen I和 Collagen IV 表達均高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)；SCI 后 7 天 Collagen I 和 Collagen IV的表達最高，與其它時間點相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05) (表2，圖2、3)。

四、Western blot

圖1 尼氏染色觀察各組脊髓神經(jīng)元形態(tài) (× 200) (注：黑色箭頭所示為尼氏體，紅色箭頭所示為瘀血)Fig.1 Observation of spinal neuron morphology in each group by Nissl staining (× 200) (Notice: Black arrows showed the Nissl body and the red arrows showed the blood stasis)

圖2 免疫組化觀察各組 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表達情況 (× 200) (注：紅色箭頭所指為陽性反應)Fig.2 Immunohistochemical observation of the expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in each group (× 200) (Notice: Red arrows showed the positive reaction)

表2 各-組大鼠 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表達平均光密度值 (± s)Tab.2 The mean optical -density of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in rats of each group (± s)

表2 各-組大鼠 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表達平均光密度值 (± s)Tab.2 The mean optical -density of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in rats of each group (± s)

注：與假手術組相比，aP＜0.05；與術后其它組相比，bP＜0.05Notice: Compared with the sham group, aP < 0.05; Compared with other surgery groups, bP < 0.05

組別 n (只)TIMP-2 Collagen I Collagen IV假手術組 6 0.36±0.18 0.23±0.11 0.29±0.15術后 3 天組 6 0.56±0.13a 0.41±0.16a 0.43±0.11a術后 5 天組 6 0.78±0.11ab 0.50±0.19a 0.59±0.15a術后 7 天組 6 0.63±0.16a 0.77±0.17ab 0.79±0.13ab術后 9 天組 6 0.58±0.13a 0.52±0.13a 0.53±0.15a F 值 3.02 2.78 4.32 P 值 0.00 0.00 0.00

圖3 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 相對表達量變化趨勢Fig.3 Variation trend of relative expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV

Western blot 結果顯示假手術組的 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量較低。SCI 后TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量逐漸增高。SCI 各組中除術后 9 天組外，其它組的 TIMP-2 蛋白表達量均高于假手術組且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；SCI 后 5 天 TIMP-2 蛋白表達量最高，與其它時間點相比差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。SCI 各組 Collagen I 和 Collagen IV 的蛋白表達量均高于假手術組，且差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)；Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量于 SCI 后 7 天最高，與其它時間點相比差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)(表3，圖4、5)。

表3 各組大鼠 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量(± s)Tab.3 The mean optical density of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in rats of each group (± s)

表3 各組大鼠 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量(± s)Tab.3 The mean optical density of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in rats of each group (± s)

注：與假手術組相比，aP＜0.05；與術后其它組相比，bP＜0.05Notice: Compared with the sham group, aP < 0.05; Compared with other surgery groups, bP < 0.05

組別 n (只)TIMP-2 Collagen I Collagen IV假手術組 6 0.77±0.17 0.28±0.10 0.25±0.15術后 3 天組 6 0.82±0.16a 0.38±0.17a 0.39±0.13a術后 5 天組 6 0.92±0.12ab 0.53±0.18a 0.52±0.18a術后 7 天組 6 0.84±0.15a 0.54±0.17ab 0.57±0.16ab術后 9 天組 6 0.78±0.14a 0.39±0.16a 0.41±0.19a F 值 5.56 4.57 8.46 P 值 0.00 0.00 0.00

圖4 各組 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量 (注：與假手術組相比，aP ＜ 0.05；與術后其它組相比，bP ＜ 0.05)Fig.4 Protein expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in each group (Notice: Compared with the sham group, aP ＜ 0.05;Compared with other surgery groups, bP ＜ 0.05)

圖5 Western blot 檢測各組 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV蛋白表達情況Fig.5 Expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in each group by Western blot

討 論

SCI 包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷主要是由于脊髓受到機械性打擊造成組織結構破壞，包括細胞死亡，細胞外基質間相互作用被切斷，損傷局部出現(xiàn)水腫，血脊髓屏障被破壞，以及炎癥發(fā)生，炎癥細胞浸潤和炎性因子浸潤，內環(huán)境紊亂等，原發(fā)性損傷后，由于血脊髓屏障通透性增加，導致血管內物質大量外漏，進一步加劇出血、水腫、炎癥等繼發(fā)性損傷[1-3,11]。在本實驗中隨著時間的推移，SCI 大鼠的 BBB 評分結果提示損傷后7 天開始顯著升高，說明其肢體功能障礙改善可能與炎癥逐漸消散，內環(huán)境慢慢修復，出血和水腫進一步減輕有關。這也與相關實驗結果與本實驗結果相一致[12]。

TIMP-2 是一種可溶性的低分子量分泌型糖蛋白，其作為一種內源性的酶類，能夠抑制 ECM 成分(如：膠原、明膠、蛋白多糖、基膜等) 的降解，在促進傷口修復，抑制炎性反應等過程中起到重要作用[4,13]。TIMP-2 不僅能抑制 ECM 成分的降解，同時，還能發(fā)揮細胞生長因子樣作用，促進膠原蛋白生成及成肌纖維細胞的增生活化[14]。在本實驗中，SCI 大鼠可見大量 TIMP-2 表達，并在術后 5 天達到高峰，可能的機制是 SCI 發(fā)生后原有血脊髓屏障發(fā)生破壞，維持脊髓組織中微血管內皮骨架結構血管基膜發(fā)生裂解，其完整性受到破壞，開始出現(xiàn)水腫，炎癥，出血，缺氧，細胞凋亡，神經(jīng)元受損等病理現(xiàn)象，TIMP-2 被激活并開始大量表達[2,8,11]。TIMP-2 維持在較高表達水平后，對 ECM 的降解發(fā)揮抑制作用，從而維持損傷內環(huán)境的穩(wěn)定，有利于組織修復。但術后 5 天由于組織慢慢恢復，缺氧、缺血得到改善，對內皮細胞，神經(jīng)元等的刺激也逐漸減弱，因此，TIMP-2 也不會被過度激活，其表達逐漸降低。TIMP-2 與 MMPs 相結合后形成酶原－TIMP 復合體，從而抑制 MMPs 的活性。在一般正常生理情況下，此二者的比例是保持一種動態(tài)平衡關系，從而維持著 ECM 有序的合成和降解。在病理狀態(tài)下，二者的平衡被打破，如脊髓損傷后，炎癥因子釋放過多，基質大量被溶解，EMC 降解減少，因此造成積聚[15-17]。MMPs 被激活后，就能夠發(fā)揮降解 EMC 的生物學作用。因此將其活性嚴格地控制在一定的程度，對維持機體的正常穩(wěn)定狀態(tài)具有重要的意義。

Collagen I 主要來自哺乳動物正常組織中真皮層，成纖維細胞、成骨細胞、成軟骨細胞等，具有形成和保持骨與結締組織的完整性的作用[18]。研究也表明，Collagen I 能夠參與損傷血管的重新構建，與血管形成密切相關，同時在形成特定的細胞外微環(huán)境中也起到主要作用，而這些特定的細胞外微環(huán)境對于細胞生存，維持細胞完整性及細胞之間信號傳遞有著重要意義和作用[9,19]。此外，Collagen I 可以通過盤蛋白、整合素等向細胞內傳遞細胞外環(huán)境中的刺激信號，發(fā)揮其生物學功能；通過截留、保存、運輸生長因子從而起到信號分子的作用[9,20]。這些功能在器官發(fā)育、傷口組織愈合與修復中發(fā)揮重要作用。在正常脊髓組織中，Collagen I 并無明顯表達，SCI 后，由于出血，水腫等病理因素的刺激，Collagen I 開始表達[21]。

Collagen IV 作為 ECM 中基膜的主要組成組分，廣泛分布于全身組織，起組織連接、促進損傷血管再生作用，對維持內環(huán)境的平衡穩(wěn)定具有重要意義[22-24]。Collagen IV 在正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，僅存在于微血管周圍和腦脊膜中，由血管內皮細胞分泌并包繞血管內皮細胞，也是構成微血管管壁的主要成分之一，在脊髓實質中的其它部分并無明顯表達[8]。當脊髓受到打擊后，ECM 遭到破壞，基膜成分開始裂解，血管內皮細胞壞死、凋亡，Collagen IV 開始降解，但由于生理病理因素的影響，血管再生機制被很快激活，作為構成微血管主要成分的Collagen IV 開始大量合成，研究表明，SCI 早期，Collagen IV 的合成有利于阻礙炎癥的發(fā)生[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)術后 3 天 Collagen I、Collagen IV 開始明顯表達，術后 7 天 Collagen I、Collagen IV 表達到最高峰，隨后開始慢慢下降。其可能的機制為：SCI 后，TIMP-2，Collagen I、Collagen IV 開始表達，高表達的 TIMP-2 促進 Collagen IV 過度表達，同時過度表達的 Collagen IV 形成的某種機械屏障能限制軸突再生，從而阻礙神經(jīng)功能的恢復，此時Collagen I 表達水平也并未很高，對組織的修復能力很弱。術后 5 天，TIMP-2 表達到最高峰隨后開始下降，其對 Collagen IV 表達的促進作用減弱，Collagen IV 表達減少，機械屏障開始分解，神經(jīng)正常的生理功能得以恢復，與此同時 Collagen I 在損傷后 7 天表達最高，其所發(fā)揮的血管重建，組織修復等作用也達到最高峰，所以 BBB 評分在損傷后 7 天顯著升高。研究證明[26-27]，SCI 后過度表達的 Collagen IV形成的膠質瘢痕發(fā)揮機械屏障作用，能夠限制軸突的再生與傳導功能，從而影響神經(jīng)功能的恢復。

本實驗研究結果為治療 SCI 提供一個新思路，即在損傷早期提高 Collagen I 的表達，通過調控TIMP-2 的表達，控制 Collagen IV 表達水平使其不形成膠質瘢痕的同時還能限制炎癥反應。

參 考 文 獻

[1]王想福, 王興盛, 王國玉. 脊髓損傷的藥物治療研究進展[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志, 2014, (8):76-78.

[2]Volarevic V, Erceg S, Bhattacharya SS, et al. Stem cellbased therapy for spinal cord injury[J]. Cell Transplant, 2013,22(8):1309-1323.

[3]Min SH, Lee SH, Shim H, et al. Development of complete thoracic spinal cord transection model in rats for delayed transplantation of stem cells[J]. Spine, 2011, 36(3):155-163.

[4]?ukaszewicz-Zaj?c M, Mroczko B, Guzińska-Ustymowicz K, et al. Matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) and their tissue inhibitor 2 (TIMP-2) in gastric cancer patients[J]. Adv Med Sci,2013, 58(2):235-243.

[5]Hsu JY, Mckeon R, Goussev S, et al. Matrix metalloproteinase-2 facilitates wound healing events that promote functional recovery after spinal cord injury[J]. J Neurosci, 2006,26(39):9841.

[6]Page-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z. Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(3):29-33.

[7]Yong VW, Agrawal SM, Stirling DP. Targeting MMPs in acute and chronic neurological conditions[J]. Neurotherapeutics,2007, 4(4):580-589.

[8]Anik I, Kokturk S, Genc H, et al. Immunohistochemical analysis of TIMP-2 and collagen types I and IV in experimental spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats[J]. J Spinal Cord Med, 2011, 34(3):257-264.

[9]Dunham KA, Floyd CL. Contusion models of spinal cord injury in rats[M]. Humana Press. 2011: 345-362.

[10]D’Amico F, Skarmoutsou E, Mangano K, et al. Isoproterenol modulates matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and its tissue inhibitor-2 (TIMP-2) in rat parotid gland[J]. Arch Oral Biol,2013, 58(4):370-376.

[11]Sharma HS. Pathophysiology of blood-spinal cord barrier in traumatic injury and repair[J]. Curr Pharm Des, 2005,11(11):1353.

[12]馬珊珊, 渠瑞娜, 田毅, 等. 臍帶沃頓膠干細胞移植對脊髓損傷大鼠炎癥因子表達的影響[J]. 中國組織工程研究, 2015,19(23):3729-3735.

[13]Zhang H, Adwanikar H, Werb Z, et al. Matrix metallopro-teinases and neurotrauma: evolving roles in injury and reparative processes[J]. Neuroscientist, 2010, 16(2):156-170.

[14]Larsen MB, Stephens RW, Brünner N, et al. Quantification of tissue inhibitor of metalloproteinases 2 in plasma from healthy donors and cancer patients[J]. Scand J Immunol, 2005,61(5):449-460.

[15]Gharagozlian S, Svennevig K, Bangstad HJ, et al. Matrix metalloproteinases in subjects with type 1 diabetes[J]. BMC Clin Pathol, 2009, 9(1):7.

[16]Yang J, Zhou Q, Wang Y, et al. Effect of high glucose on PKC and MMPs / TIMPs in human mesangial cells[J].Zhongnandaxue Xuebao Yixueban, 2009, 34(5):425-431.

[17]Kowluru RA, Kanwar M. Oxidative stress and the development of diabetic retinopathy: contributory role of matrix metalloproteinase-2[J]. Free Radic Biol Med, 2009,46(12):1677-1685.

[18]Giannelli G, Bergamini C, Marinosci F, et al. Clinical role of MMP-2 / TIMP-2 imbalance in hepatocellular carcinoma[J]. Int J Cancer, 2002, 97(4):425.

[19]Haifei S, Xingang W, Shoucheng W, et al. The effect of collagen-chitosan porous scaffold thickness on dermal regeneration in a one-stage grafting procedure[J]. J Mech Behav Biomed Mater, 2014: 114-125.

[20]Hong F, Saiman Y, Si C, et al. X4 Human immunodeficiency virus type 1 gp120 promotes human hepatic stellate cell activation and collagen I expression through interactions with CXCR4[J]. PloS One, 2012, 7(3):e33659.

[21]Kong D, Kong X, Wang L. Effect of cardiac lymph flow obstruction on cardiac collagen synthesis and interstitial fibrosis[J]. Physiol Res, 2006, 55(3):253-258.

[22]Cardoso FL, Brites D, Brito MA. Looking at the bloodbrain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.[J]. Brain Res Rev, 2010, 64(2):328.

[23]Takigawa T, Yonezawa T, Yoshitaka T, et al. Separation of the perivascular basement membrane provides a conduit for inflammatory cells in a mouse spinal cord injury model[J].J Neurotrauma, 2010, 27(4):739-751.

[24]Anik I, Kokturk S, Genc H, et al. Immunohistochemical analysis of TIMP-2 and collagen types I and IV in experimental spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats[J]. J Spinal Cord Med, 2011, 34(3):257-264.

[25]Wu HJ, Yiu WH, Li RX, et al. Mesenchymal stem cells modulate albumin-induced renal tubular inflammation and fibrosis[J]. PloS One, 2014, 9(3):e90883.

[26]Liesi P, Kauppila T. Induction of type IV collagen and other basement-membrane-associated proteins after spinal cord injury of the adult rat may participate in formation of the glial scar[J].Exp Neurol, 2002, 173(1):31-45.

[27]Iseda T, Nishio T, Kawaguchi S, et al. Spontaneous regeneration of the corticospinal tract after transection in young rats:collagen type IV deposition and astrocytic scar in the lesion site are not the cause but the effect of failure of regeneration[J].J Comp Neurol, 2003, 464(3):343-355.