韋忠明

摘 要：當(dāng)前，我國(guó)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)濫用抗生素的現(xiàn)象，導(dǎo)致患者的生命安全受到極大威脅，誘發(fā)多種微生物菌株，且在發(fā)明新抗生素的時(shí)候，需耗費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間，無(wú)法滿足當(dāng)前的發(fā)展需求，因此，為了提升抗生素藥物的安全性，下文針對(duì)畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)中的抗菌肽工藝進(jìn)行分析，以實(shí)驗(yàn)的方式表達(dá)，得出準(zhǔn)確的結(jié)論，以供參考。

關(guān)鍵詞：畢赤酵母基因工程；菌發(fā)酵生產(chǎn)；抗菌肽工藝

中圖分類號(hào)：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2018）07-0220-01

抗菌肽屬于新型的抗菌藥物，屬于具有較大潛力的抗生素替代制劑，當(dāng)前，我國(guó)已經(jīng)研究出將近一千種抗菌肽，每種都具備特殊的抗菌機(jī)理，與抗生素相較，不容易產(chǎn)生耐藥性，熱穩(wěn)定較高，因此，需合理使用抗菌肽，代替抗生素藥物。

1 實(shí)驗(yàn)中的材料與方式

1.1 材料分析

本次實(shí)驗(yàn)之前構(gòu)建了抗菌肽畢赤酵母基因工程菌LY，并使用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)中選擇的試劑為酵母粉、蛋白胨、天門冬氨酸、三氯乙酸、甲醇試劑、氯化鈉試劑與葡萄糖試劑。

1.2 明確培養(yǎng)基的配方

在實(shí)驗(yàn)中，主要使用的為酵母種子與固體兩種培養(yǎng)基類型。前者的配方為：酵母粉（1%）、蛋白胨（2%）、葡萄糖（3%），且pH值呈現(xiàn)自然的狀態(tài)。后者培養(yǎng)基的配方為：酵母粉（0.6%）、蛋白胨（1.1%）、氯化鈉（1.1%）、瓊脂粉（2.1%），且pH值呈現(xiàn)自然的狀態(tài)。

1.3 具體的實(shí)驗(yàn)方式分析

1.3.1 對(duì)菌株的重組進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)

可篩選陽(yáng)性的酵母菌株，將其放置在YPD液體中實(shí)現(xiàn)一級(jí)培養(yǎng)，液體劑量為5ml，溫度為30攝氏度，以每分鐘200r的速度振蕩，在等于2的時(shí)候，取出1ml培養(yǎng)液，在YPD中重新培養(yǎng)，繼續(xù)振蕩，24個(gè)小時(shí)之后加入濃度為1.1%的甲醇，并培養(yǎng)48個(gè)小時(shí)，然后以每分鐘8000r的速度進(jìn)行離心，時(shí)間為10分鐘，針對(duì)表達(dá)上清液進(jìn)行全面的收集，并取出的表達(dá)上清液，實(shí)現(xiàn)抑菌實(shí)驗(yàn)工作。在抑菌實(shí)驗(yàn)中，使用21%的三氯乙酸溶液針對(duì)上清液進(jìn)行沉淀，然后加入4攝氏度左右的注射用水，以每分鐘14000r的速度進(jìn)行離心，時(shí)間為20分鐘，針對(duì)沉淀物進(jìn)行收集，然后放置在0.6ml的PBS溶液中進(jìn)行處理，在電泳分析的情況下，明確三分子多肽的實(shí)際表達(dá)產(chǎn)物情況。

1.3.2 利用瓊脂擴(kuò)散方式針對(duì)抗菌肽的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定

篩選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的大腸桿菌與金色葡萄球菌，并制作成為浮液，各自為15，將其與LB固體培養(yǎng)基均勻攪拌，固體培養(yǎng)基的溫度為56攝氏度，劑量為31ml，然后平鋪在平板中，在溶液凝固之后，在平板上面放置牛津杯，然后將已經(jīng)保存的上清液放置在牛津杯中，劑量為100，在此期間，可以將平板設(shè)置在溫度為37.5攝氏度的恒溫培養(yǎng)箱中，待過(guò)夜之后，將其與體積相同且空載體轉(zhuǎn)化的酵母上清液進(jìn)行隱性對(duì)照，在第二天的時(shí)候，合理仔細(xì)觀察抑菌圈，并記錄大小數(shù)據(jù)，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.3.3 針對(duì)抗菌肽的表達(dá)培養(yǎng)基相關(guān)配方進(jìn)行合理優(yōu)化處理

本實(shí)驗(yàn)可以使用四個(gè)因素、三個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，制定完善的設(shè)計(jì)方案，在正交試驗(yàn)的過(guò)程中，全面觀察培養(yǎng)基中碳源對(duì)菌株相關(guān)抗菌肽表達(dá)方式的影響情況。如果酵母膏的濃度為1%、蛋白胨的濃度為2%，就可以針對(duì)谷氨酸與天冬氨酸的實(shí)際情況進(jìn)行分析，了解其對(duì)于菌株抗菌肽實(shí)際表達(dá)的影響情況。

1.3.4 針對(duì)抗菌肽的實(shí)際表達(dá)條件進(jìn)行合理的優(yōu)化

在優(yōu)化抗菌肽實(shí)際表達(dá)條件的時(shí)候，可以使用三種方式。其一，了解培養(yǎng)基的pH值，在充足抗菌肽方面的表達(dá)影響情況。其二，了解不同甲醇濃度的表達(dá)影響。其三，了解發(fā)酵時(shí)間的表達(dá)影響[1]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 針對(duì)抗菌肽進(jìn)行表達(dá)

在實(shí)驗(yàn)之后可以發(fā)現(xiàn)，通過(guò)空載體酵母與重組酵母的分析，可以得到上清液蛋白的具體結(jié)果，其中，重組酵母上清液中，主要蛋白質(zhì)條帶分子量在4.1kda左右，而對(duì)于空載體的酵母而言，在陰性對(duì)照期間，沒(méi)有條帶，因此，需合理使用實(shí)驗(yàn)方式。

2.2 不同碳源的實(shí)際影響情況

在酵母菌抗菌肽表達(dá)方面，不同碳源會(huì)對(duì)其造成不同的影響。在正交實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，空白R(shí)數(shù)據(jù)為0.07，而葡萄糖R數(shù)據(jù)為0.08，可以說(shuō)明，葡萄糖碳源對(duì)于抗菌肽的表達(dá)情況所產(chǎn)生影響很小。對(duì)于甘油而言，R數(shù)據(jù)為0.56，屬于幾種碳源中，對(duì)抗菌肽表達(dá)情況影響最大的元素[2]。

2.3 谷氨酸與天冬氨酸的實(shí)際影響分析

使用正交實(shí)驗(yàn)方式，針對(duì)酵母粉與蛋白胨等進(jìn)行研究，了解此類有機(jī)氮源在酵母抗菌肽表達(dá)方面的實(shí)際影響情況，可以發(fā)現(xiàn)，有機(jī)氮源對(duì)其產(chǎn)生的影響很小，且在實(shí)驗(yàn)中，可以嘗試添加不同的氨基酸，利用氨基酸的表達(dá)方式，協(xié)調(diào)天冬氨酸表達(dá)，以此提高抗菌肽表達(dá)的靈活性。在實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，0.26%谷氨酸制劑與0.6%天冬氨酸制劑會(huì)促進(jìn)抗菌肽的表達(dá)，但是，繼續(xù)增加濃度，不會(huì)產(chǎn)生明顯的促進(jìn)效果[3]。且在使用0.26%谷氨酸的時(shí)候，抑菌圈的直徑可以達(dá)到1.9cm左右，而使用0.6%的天冬氨酸，抑菌圈的直徑在1.75cm左右，且谷氨酸的價(jià)格很低，因此，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，可將谷氨酸作為主要的氮源，并將濃度控制為0.26%。

2.4 表達(dá)條件實(shí)際優(yōu)化分析

在使用甲醇材料的時(shí)候，需在不同濃度、pH值與發(fā)酵時(shí)間的條件之下進(jìn)行比較與研究，在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)，將酵母菌轉(zhuǎn)結(jié)到培養(yǎng)基（pH5.5）中，將培養(yǎng)時(shí)間控制在24小時(shí)，之后添加1.5%的甲醇材料，在30攝氏度的空間中培養(yǎng)72小時(shí)，可得到最高的抗菌肽表達(dá)成效[4]。

2.5 優(yōu)化之前與之后發(fā)酵液對(duì)抑菌活性的影響對(duì)比

在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，需針對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，可實(shí)現(xiàn)檸檬酸銨、蛋白胨與酵母膏之間的發(fā)酵，在了解發(fā)酵工藝條件的情況下，明確最終的結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用革蘭陽(yáng)性的金色葡萄球菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化之后的抗菌肽效果比優(yōu)化之前高出57%左右，且在實(shí)驗(yàn)中也可以發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性大腸桿菌會(huì)受到抗菌肽的抑制性影響，且優(yōu)化之后比優(yōu)化之前的效果高出63%左右。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，可以了解到革蘭陰性與陽(yáng)性菌會(huì)受到抗菌肽的抑菌作用，屬于廣譜的抗菌肽，且在研究中表面，利用發(fā)酵培養(yǎng)基與相關(guān)工藝技術(shù)的優(yōu)化方式，能夠促進(jìn)酵母菌株的抗菌肽表達(dá)，并形成良好的處理依據(jù)，可全面優(yōu)化具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絒5]。

3 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前，我國(guó)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)濫用抗生素的現(xiàn)象，導(dǎo)致抗生素的使用效果降低，甚至誘導(dǎo)多種抗生素的抗性菌株增加，且我國(guó)在新型抗生素方面，開(kāi)發(fā)與研究需要很長(zhǎng)時(shí)間，耗費(fèi)的成本也很高，無(wú)法與耐藥性菌株的臨床發(fā)展速度相較，導(dǎo)致人們的身體健康受到嚴(yán)重威脅，這也導(dǎo)致人們?cè)诎踩?qū)使之下，迫切追求新型的抗菌制劑。而抗菌肽屬于新型抗菌藥物，可以成為抗生素的替代制劑，當(dāng)前，我國(guó)已經(jīng)得到了抗菌肽的研究成果，并在實(shí)際研究中，實(shí)現(xiàn)抗菌譜的優(yōu)勢(shì)，因此，在臨床治療發(fā)展中具備很高的發(fā)展前景。上述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得出了準(zhǔn)確的結(jié)論，可以形成借鑒性。

參考文獻(xiàn)

[1]郝思怡.金環(huán)蛇抗菌肽Cath-BF在畢赤酵母中的組成型分泌表達(dá)[D].廣東藥學(xué)院，2015.

[2]王爾群.雞AvBD6成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性分析[D].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[3]魏海婷.AvBD2在畢赤酵母中的組成型表達(dá)及其發(fā)酵條件優(yōu)化[D].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[4]阮海寧.生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)谷胱甘肽的工藝研究[D].浙江大學(xué)，2014.

[5]郭晉霞.重組雙堿基內(nèi)肽酶在畢赤酵母中的表達(dá)制備及酶活鑒定[D].重慶理工大學(xué)，2016.