劉延杰 陳彎彎 向碧云 朱旭東 郝曉冉

（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875）

從天然產(chǎn)物中提取、分離和表征生物小分子，是新藥研發(fā)中獲得先導(dǎo)化合物的主要途徑之一。層析法（Chromatography）是天然產(chǎn)物分離最常用的方法之一。層析法最早是根據(jù)化合物顏色分離一些植物色素，如今，層析法已經(jīng)演變成為一種高度敏感的、有效的化合物分離和鑒定方法［1-8］。柱層析一般包括常壓柱層析、中壓柱層析和高壓柱層析。按照柱填料又可分為硅膠柱層析（Silica gel column chromatography）、離子交換層析（Ionexchange chromatography，IEC）、凝膠滲透色譜（Gel-permeation /molecular sieve chromatography，GPC）、疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatography，HIC）等［9］，其中以硅膠柱層析（正／反相）使用最為廣泛。與其他層析方法相比，柱層析具有操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，樣品承載量大等優(yōu)點(diǎn)，是天然產(chǎn)物分離純化的首選方法之一［10-12］。

硅膠柱層析分為正相硅膠柱層析和反向硅膠柱層析2 種，正相硅膠柱層析填料為正相硅膠，適合分離相對(duì)極性較小的化合物，例如各類苷元；所以通常選用極性較小的有機(jī)溶劑作為洗脫劑，例如石油醚-二氯甲烷洗脫系統(tǒng)，氯仿-乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)等。反向硅膠柱層析使用的是反相硅膠，適合分離極性相對(duì)較大的化合物，例如生物堿等各類苷類，常采用甲醇-水，乙腈-水不同比例作為洗脫劑。

硅膠柱層析在上樣時(shí)，常分為干法上樣和濕法上樣。干法上樣將待分離物質(zhì)溶解后拌在少量硅膠G 中，待揮發(fā)至干后填入裝好的硅膠柱中，再加層析液進(jìn)行洗脫。濕法上樣先將硅膠G 用洗脫液溶脹后裝入硅膠柱，再將溶解好的樣品倒入硅膠柱進(jìn)行分離。這2 種方法對(duì)物質(zhì)分離效果差別不大，濕法上樣操作簡(jiǎn)單便捷，但溶解樣品最好用二氯甲烷、乙酸乙酯等極性較小的溶劑，對(duì)于一些溶解度小的物質(zhì)，宜使用干法上樣。本文以常壓正相硅膠柱的干法上樣為例，對(duì)小孢擬盤多毛孢紅薯渣發(fā)酵產(chǎn)物二氯甲烷粗提物進(jìn)行初步分離。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 二氯甲烷相粗提物約1 g；100～200 目硅膠G 約100 g （青島海洋化工廠分廠）；內(nèi)徑×柱高=2.5 cm×40 cm 玻璃柱；Si60 F254 TLC 薄層層析板（默克化工技術(shù)有限公司）；0.3 mm 毛細(xì)管。10%硫酸乙醇顯色液；二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇（分析級(jí)，北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司）。

1.2 層析液比例確定 由于TLC 法操作簡(jiǎn)單，且層析原理與硅膠柱層析一致，所以確定硅膠柱層析層析條件時(shí)一般用TLC 探索條件。TLC 法分為正相TLC 和反向TLC 2 種。由于硅膠柱層析可以近似地看作TLC 板多次展開系統(tǒng)，樣品洗脫速率要比TLC 板上展開速率快，所以一般選用Rf值為0.3～0.5 的層析液進(jìn)行硅膠柱層析。

具體操作方法如下：

1）用玻璃刀將現(xiàn)成的TLC 板裁成2 cm×8 cm左右小板，用毛細(xì)管將稀釋后適當(dāng)濃度的粗提物樣品點(diǎn)在離TLC 板短邊緣1 cm 處正中央。注意樣品點(diǎn)盡可能小，可及時(shí)用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干。

2）選擇二氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶0，9∶1，1∶1 和0∶1 對(duì)樣品進(jìn)行TLC 展開，待層析液跑至上邊緣0.5 cm 處停止展開，用吹風(fēng)機(jī)吹干硅膠板上的有機(jī)試劑。

3）將展開好的TLC 板用硫酸乙醇液顯色后觀察（圖1），目標(biāo)物質(zhì)的Rf 值分別為0.15，0.5，0.8和0.9，選取Rf=0.3-0.5 的層析液作為硅膠柱層析的層析液，所以選擇二氯甲烷∶乙酸乙酯=9∶1 為柱層析層析液。

若不確定待分離樣品極性，可按照有機(jī)溶劑極表從小到大依次嘗試摸索極性。常用的溶劑極性從小到大依次為： 石油醚＜環(huán)己烷＜苯＜二氯甲烷＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水。選擇層析液極性越大，樣品點(diǎn)越接近溶劑前沿；極性越小，樣品點(diǎn)越接近原點(diǎn)。單一溶劑一般達(dá)不到層析要求，通常選擇2 種或3 種溶劑混合使用，還要考慮到溶劑間的溶解度問(wèn)題。常見的混合溶劑組合有：石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮，二氯甲烷/乙酸乙酯，二氯甲烷/甲醇，乙酸乙酯/甲醇等。

1.3 拌樣 拌樣是硅膠柱層析干法上樣的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。拌樣所用的硅膠G 的量要合適，一般以樣品質(zhì)量∶硅膠G 質(zhì)量=1∶3 為宜。若硅膠G 過(guò)多，則柱層析樣品層過(guò)厚，各個(gè)組分容易發(fā)生交錯(cuò)重疊；若硅膠G 過(guò)少，則樣品不能完全吸附在硅膠G 中，使樣品損失嚴(yán)重。此外，拌樣不均勻也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。

具體方法如下：

1）稱取1 g 粗提物，按照粗提物質(zhì)量∶硅膠G質(zhì)量=1∶3 稱取3 g 硅膠G 于蒸發(fā)皿中。

2）將樣品用有機(jī)試劑完全溶解，在通風(fēng)廚中吸取少量樣品滴加到硅膠G 中，用藥勺將樣品攪拌均勻，待樣品揮發(fā)至干后繼續(xù)滴加樣品，直至將樣品全部拌入硅膠G 中。期間不斷用藥勺攪拌硅膠G 防止拌樣不均勻。

3）將揮發(fā)干的硅膠G 在通風(fēng)廚中放置過(guò)夜，使有機(jī)試劑完全揮發(fā)。

1.4 裝柱 裝柱是硅膠柱層析最重要的環(huán)節(jié)，柱子質(zhì)量直接決定樣品的分離效果和得率。首先，保證柱身豎直，否則洗脫時(shí)樣品條帶會(huì)呈傾斜，嚴(yán)重時(shí)洗脫產(chǎn)物不純，需要重新純化。其次，硅膠G 要壓實(shí)，不能留有氣泡，否則樣品條帶會(huì)呈彌散型，影響分離效果。具體步驟如下：

1）將玻璃柱豎直架于鐵架臺(tái)上。

2）按照質(zhì)量比樣品∶硅膠G=1∶40 稱取硅膠G 40 g。將硅膠G 倒入硅膠柱內(nèi)，拍打柱身使硅膠粉壓實(shí)，期間不斷旋轉(zhuǎn)柱體，使硅膠G 填充均勻。

3）將拌好樣的硅膠G 倒入硅膠柱內(nèi)，同樣拍打柱身并不斷旋轉(zhuǎn)柱體，使樣品層均勻。

4）在樣品層上鋪一層約0.5 cm 厚的硅膠G，防止加層析液時(shí)樣品層飛濺。

1.5 樣品接收 配制3 倍柱體積的層析液，超聲10 min。打開玻璃柱閥門，緩慢將層析液傾倒入硅膠柱內(nèi)至滿。選擇合適大小的試管接收流出液，一般10～20 mL/管為宜，流速1 mL/min，過(guò)快樣品拖尾嚴(yán)重，過(guò)慢則樣品條帶彌散。

如果目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)極性相差不大，可以采用梯度層析系統(tǒng)。梯度層析又稱梯度洗脫，是指用不同極性洗脫劑分別對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，達(dá)到分離的效果。正相硅膠柱層析如需要梯度層析，則按照層析液極性由小到大依次倒入物質(zhì)硅膠柱內(nèi)。注意層析液極性差別不應(yīng)過(guò)大，且換層析液極性前，盡可能將硅膠上方的層析液流盡。

1.6 檢測(cè)與合并 以20 mL/管收集流出液，共收集10 管，分別對(duì)這10 管流出液進(jìn)行TLC 檢測(cè)，展開劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=9∶1（圖3）。合并1～4 管，5～7 管，8～10 管，旋蒸至干計(jì)算樣品質(zhì)量，分別為7 mg，10 mg 和4 mg。分別轉(zhuǎn)移至EP管中，編號(hào)樣品1、2、3，-20℃保存。

合并時(shí)如果樣品量足夠，為了保證純度，可以棄去純度不高的接收液；如果樣品量少，不足以進(jìn)行之后的產(chǎn)物鑒定實(shí)驗(yàn)，要將所有含有目標(biāo)物質(zhì)的接收液合并，并進(jìn)一步純化。

2 硅膠柱層析注意事項(xiàng)及常見問(wèn)題解決

1）檢查硅膠柱閥門是否泄漏。一是玻璃柱使用前，首先檢查氣密性，保證閥門完好不漏液；二是將硅膠G 裝入硅膠柱后，先打開硅膠柱閥門檢查是否有硅膠漏出，并不斷拍打柱身，使硅膠柱裝填均勻。三是在洗脫過(guò)程中關(guān)注閥門處是否有液體滲出。

2）在用洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí)，防止洗脫液流干。硅膠柱層析是一個(gè)持續(xù)洗脫的過(guò)程，期間應(yīng)該保證樣品一直處于洗脫狀態(tài)。如果洗脫液流干后再補(bǔ)加洗脫液，則會(huì)在柱子中殘留氣泡影響分離效果。

3）硅膠柱出現(xiàn)裂縫。層析液流干或者裝柱時(shí)硅膠G 不均勻都可能造成硅膠柱出現(xiàn)裂縫。如果目標(biāo)物質(zhì)已被沖到裂縫下方，對(duì)分離效果影響較小，可以繼續(xù)用洗脫液洗脫；如果裂縫較大，嚴(yán)重影響分離效果，可用甲醇將所有樣品全部沖下，蒸發(fā)濃縮后再次柱層析。

4）回收產(chǎn)物成分仍然很復(fù)雜。如果各個(gè)組分之間極性差別較大，可能是洗脫液極性偏大，可以適當(dāng)減小洗脫液極性或者選擇10 mL/管或者更小體積接收洗脫液；如果各組分之間極性差別較小，可以通過(guò)適當(dāng)降低流速改善，也可以選擇制備成硅膠板或者葡聚糖凝膠柱等其他純化方式進(jìn)一步純化。

3 結(jié)論

常壓硅膠柱層析操作簡(jiǎn)單、廉價(jià)，且載樣量大，因而常用于分離純化天然產(chǎn)物。本文以1 g 粗品的開放性硅膠柱分離為例，通過(guò)干法上樣，TLC檢測(cè)后合并流出液，將3 種不同物質(zhì)初步分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)開放性硅膠柱層析能夠很好地將極性不同的物質(zhì)分離。工業(yè)上一般應(yīng)用多次硅膠柱層析純化，或者將硅膠柱層析與分子篩、離子交換層析等其他分離純化方法結(jié)合，以取得更好的純化效果。