盛 青，謝 貝，劉志輝，馬志明，譚俊豪

慢性阻塞性肺疾病(簡(jiǎn)稱慢阻肺)，是一種以持續(xù)氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的嚴(yán)重危害人類健康的疾病，氣流受限多呈進(jìn)行性發(fā)展，至2020年慢阻肺將居全球患者疾病死亡原因的第三位[1]。目前臨床上慢阻肺的確切病因尚不明確，但多數(shù)人認(rèn)為包括多種致病機(jī)制，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等[2-4]，而近年來(lái)有許多研究顯示自噬作用也參與了慢阻肺的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[5-7]。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)主要的改變是氣道對(duì)香煙煙霧(CS)的異常炎癥反應(yīng)，這一炎性變化與氣道上皮細(xì)胞功能失調(diào)、纖毛縮短和粘液纖毛清除障礙有關(guān)[8]。在LC3B敲除小鼠和這些小鼠來(lái)源的氣管上皮細(xì)胞中，CS誘導(dǎo)的自噬水平下降，且纖毛縮短程度也減輕。組蛋白脫乙酰酶6 (HDAC6)是組蛋白去乙酰化酶(histone deace-tylases，HDACs)家族成員之一，是細(xì)胞內(nèi)CS暴露期間自噬介導(dǎo)的纖毛縮短的重要調(diào)節(jié)因子，在HDAC6敲除小鼠和這些小鼠來(lái)源的氣管上皮細(xì)胞中，CS誘導(dǎo)的自噬水平也下降以及纖毛縮短程度減輕[9]，其機(jī)制可能是通過(guò)去乙?；饔媒閷?dǎo)LC3B的乙?；揎棧M(jìn)而促進(jìn)自噬降解。而在自噬的信號(hào)通路中，LC3B已被證明受到乙?；揎椀恼{(diào)控,進(jìn)而影響其催化活性的發(fā)揮。另外，在LC3B和HDAC6敲除小鼠中，CS誘導(dǎo)的粘液纖毛清除障礙程度也更輕，而在Nrf2敲除小鼠中，CS誘導(dǎo)的粘液纖毛清除障礙程度更重[10]，且Nrf2能夠調(diào)節(jié)CS誘導(dǎo)的LC3B表達(dá)，而且Nrf2是活性最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。因此，在自噬的信號(hào)通路中，HDAC6能夠調(diào)控LC3B的乙?；揎?，促進(jìn)自噬降解，且Nrf2能夠調(diào)節(jié)LC3B的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬的形成，但其機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本文通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)慢性阻塞性肺疾病急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中LC3B、HDAC6和Nrf2的表達(dá)水平，并分析其與外周血白細(xì)胞總數(shù)、單核細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比及中性粒細(xì)胞絕對(duì)值的相關(guān)性，探討自噬相關(guān)基因LC3B、HDAC6和Nrf2在AECOPD的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年9月至2017年5月在廣州市胸科醫(yī)院呼吸科住院的AECOPD患者36例，其中男性28例，女性8例，年齡47-85歲，所有COPD患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》。慢阻肺急性加重是指患者呼吸道癥狀超過(guò)日常變異范圍的持續(xù)惡化，并需改變藥物治療方案，在疾病過(guò)程中，患者常有短期內(nèi)咳嗽、咳痰、氣短和(或)喘息加重，痰量增加，膿性或粘液膿性痰，可伴有發(fā)熱等炎癥明顯加重的表現(xiàn)[1]。本研究經(jīng)廣州市胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。納入同期健康體檢者21名為對(duì)照組，其中男性12名，女性9名，年齡43歲-78歲。

1.2 臨床樣本處理 分別收集慢阻肺急性加重患者及健康組外周血5mL至EDTA抗凝管中，用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。取5mL PBS稀釋外周血，將5mL的淋巴細(xì)胞分離液置于15 mL管底，緩慢地將稀釋血液加入至分離液上，輕輕放置離心機(jī)中，2000 rpm，升速1，降速9，離心15 min，取中間白色層，2000 rpm離心5 min，留取白色沉底。

1.3 qRT-PCR檢測(cè) 根據(jù)Total RNA Kit I說(shuō)明書抽提總RNA(OMEGA公司)；RNA濃度和A260/280比率由紫外分光光度儀檢測(cè)；通過(guò)PrimeScript?RT kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA(TAKARA公司)；qPCR由SYBR Green PCR Master Mix按照標(biāo)準(zhǔn)步驟操作(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)；所有基因的mRNA與管家基因GAPDH以2-ΔΔCT函數(shù)值進(jìn)行計(jì)算。

1.4 采用Graphpad prism 5.0進(jìn)行分析，非配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算兩組間差異，Pearson用于相關(guān)性分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LC3B、HDAC6和Nrf2在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平比較

檢測(cè)外周血LC3B、HDAC6和Nrf2的基因表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AECOPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞LC3B的表達(dá)水平(4.336±0.6328)明顯高于健康對(duì)照(1.000±0.1522)，兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0002)；HDAC6的表達(dá)水平(3.756±0.4612)明顯高于健康對(duì)照(1.000±0.05988)，兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；同時(shí)Nrf2的表達(dá)水平(0.1786±0.01333)明顯低于健康對(duì)照(0.8094±0.1111)，兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)(見(jiàn)圖1)。

圖1： 健康組和AECOPD外周血單個(gè)核細(xì)胞LC3B、HDAC6和Nrf2的表達(dá)水平比較

2.2 AECOPD患者外周血LC3B、HDAC6和Nrf2的表達(dá)水平與白細(xì)胞總數(shù)、單核細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比及中性粒細(xì)胞絕對(duì)值的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析如表1所示，AECOPD患者外周血LC3B的表達(dá)水平與白細(xì)胞總數(shù)呈正相關(guān)(r=0.5559，P=0.0314)，Nrf2的表達(dá)水平與白細(xì)胞總數(shù)無(wú)相關(guān)性(r=0.3909，P=0.1670)，同時(shí)LC3B的表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞絕對(duì)值呈正相關(guān)(r=0.5968，P=0.0188)；HDAC6的表達(dá)水平與單核細(xì)胞百分比無(wú)相關(guān)性(r=0.2944，P=0.2684)，Nrf2的表達(dá)水平與單核細(xì)胞百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.7531，P=0.0019)；LC3B和HDAC6的表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞百分比無(wú)相關(guān)性(r=-0.3795，P=0.1630；r=0.3360，P=0.2032)，Nrf2的表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5819，P=0.0370)。

3 討 論

隨著環(huán)境等的變化，慢阻肺的患者人數(shù)日益增加，其中吸煙是重要的因素，因此提高人的環(huán)境保護(hù)意識(shí)及加強(qiáng)人們對(duì)吸煙危害的認(rèn)識(shí)顯得尤為重要。而在臨床方面，如何預(yù)防和更好地治療該疾病是目前一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題，因此弄清楚其發(fā)病機(jī)制，有利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療慢阻肺病人。

表1 AECOPD患者外周血LC3B、HDAC6和Nrf2的表達(dá)水平與白細(xì)胞總數(shù)、單核細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比及中性粒細(xì)胞絕對(duì)值的相關(guān)性分析

自噬可能影響人類疾病的進(jìn)展，在調(diào)節(jié)細(xì)胞器內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)，炎癥反應(yīng)，以及先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中具有多種作用。大量的研究工作表明自噬在慢阻肺發(fā)病機(jī)制中的具有重要角色，從慢阻肺患者臨床標(biāo)本中也觀察到自噬蛋白和自噬體數(shù)目的增加[11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)敲除自噬蛋白的基因后可以抑制慢性CS誘導(dǎo)的小鼠肺氣腫的發(fā)展。

在自噬形成的過(guò)程中,多種自噬相關(guān)基因(autophagy-relatedgene,Atg)參與自噬泡的形成，其中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC3)修飾過(guò)程對(duì)自噬泡的形成必不可少，與自噬泡的形成息息相關(guān)。研究表明，自噬蛋白LC3參與氣道上皮自噬體的形成[10]。在慢阻肺病人中，自噬水平升高，LC3B-I表達(dá)水平下降，而LC3B-Ⅱ的表達(dá)增加，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)LC3B在香煙誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及肺氣腫發(fā)展中具有重要的作用[11]。Zhu等[12]發(fā)現(xiàn)，香煙抽提物(CSE)能增加氣道上皮細(xì)胞LC3B-II的表達(dá)及及吞噬小體的形成。但LC3B在慢阻肺急性加重患者外周血中的表達(dá)情況未見(jiàn)報(bào)道，為此我們研究了LC3B在AECOPD患者外周血中的表達(dá)水平并分析其與外周血白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞絕對(duì)值的相關(guān)性。結(jié)果顯示，LC3B在AECOPD患者外周血中的表達(dá)水平明顯增加，同時(shí)與外周血白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞絕對(duì)值均呈正相關(guān)，進(jìn)一步論證了在慢阻肺患者的急性加重期，自噬水平是增加的；同時(shí)可能介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的增殖、遷移等炎癥反應(yīng)，可作為觀察病情變化的一個(gè)分子指標(biāo)。

在自噬的信號(hào)通路中，LC3B已被證明受到乙酰化修飾的調(diào)控,進(jìn)而影響其催化活性的發(fā)揮，而組蛋白去乙酰酶6(HDAC6)是組蛋白去乙酰化酶蛋白家族成員之一，其研究時(shí)間最長(zhǎng)，它的作用是通過(guò)去乙酰化作用促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)基板如微管蛋白的細(xì)胞遷移等[13]。Lam[14]等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)HDAC6是吸煙暴露期間自噬介導(dǎo)氣道纖毛縮短的一個(gè)關(guān)鍵因子。具有HDAC6(HDAC6-/Y)的X染色體缺失小鼠以及這些鼠的MTECs自噬水平低下，防御CS誘導(dǎo)的纖毛變化不明顯。上述結(jié)果表明，HDAC6是氣道上皮自噬反應(yīng)過(guò)程中的重要因子。而我們的研究中發(fā)現(xiàn)HDAC6在AECOPD患者外周血中的表達(dá)水平明顯增加，表明HDAC6在COPD的急性加重期間可促進(jìn)自噬的形成，并通過(guò)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其可能與炎癥反應(yīng)的形成密切相關(guān)。

Nrf2是CNC(cap’n’collar)轉(zhuǎn)錄因子家族成員中活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要表達(dá)于如肝臟、腎臟等代謝和解毒組織中，以及其它持續(xù)暴露在環(huán)境中的組織如皮膚、肺、消化道等。與Nrf2+/+小鼠相比，長(zhǎng)期暴露于香煙煙霧(4或6個(gè)月)的Nrf2-/-小鼠，將導(dǎo)致細(xì)胞自噬增加并抑制自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，形成更嚴(yán)重的肺氣腫癥狀[15]，表明Nrf2可能是氣道上皮自噬反應(yīng)重要的調(diào)節(jié)子。而我們研究也發(fā)現(xiàn)Nrf2在AECOPD患者外周血中的表達(dá)水平明顯下降，同時(shí)AECOPD患者外周血Nrf2的表達(dá)水平與外周血單核細(xì)胞百分比和淋巴細(xì)胞百分比均呈負(fù)相關(guān)，表明Nrf2在COPD的急性加重期可抑制自噬體的形成，并進(jìn)一步抑制其炎癥程度，同時(shí)也提示Nrf2可能調(diào)節(jié)AECOPD患者的免疫過(guò)程。

我們的這一研究表明，LC3B可與HDAC6和Nrf2一起作為觀察AECOPD患者病情的分子標(biāo)志物。從另一方面，也為我們預(yù)防和治療慢阻肺提供了思路，我們或許可以利用分子靶向治療的方法調(diào)節(jié)LC3B、HDAC6和Nrf2的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)患者的自噬活性，抑制患者的炎癥反應(yīng)，最終達(dá)到治療的目的。

由于本次的實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量較少，不能全面地揭示自噬相關(guān)基因在慢阻肺急性加重發(fā)生發(fā)展中的具體作用，但創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)慢阻肺急性加重患者的炎癥反應(yīng)與外周血LC3B、HDAC6、Nrf2的表達(dá)密切相關(guān)，為今后研究慢阻肺提供了新的思路。我們后續(xù)也將進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制做出研究，以確保得出最準(zhǔn)確的結(jié)果。

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