裴慧,王立啟,王磊,王維,畢秀萍,才曉君,蘇國(guó)海,趙卓
內(nèi)源性雌激素對(duì)女性絕經(jīng)前心血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要的調(diào)節(jié)作用[1],能延緩高血壓、心力衰竭和冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)展。絕經(jīng)后雌激素替代療法對(duì)心血管疾病具有保護(hù)作用[2,3]。最初研究證實(shí),雌激素主要通過(guò)經(jīng)典雌激素受體ERα和ERβ來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而保護(hù)心血管系統(tǒng)[4,5]。隨著研究的深入,G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)作為雌激素受體的功能被發(fā)現(xiàn)[6],國(guó)際藥理學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPHAR)也將GPR30或G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1(GPER1)分類為膜雌激素受體。
GPER1參與雌激素介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄和信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[7]。GPER1主要通過(guò)快速非基因組機(jī)制參與雌激素信號(hào)的傳導(dǎo),如細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng)中的鈣動(dòng)員、激酶激活及一氧化氮產(chǎn)生等[8]。近年來(lái),特異性GPER1激活劑G1(簡(jiǎn)稱G1)[9]和抑制劑G15(簡(jiǎn)稱G15)的合成,為其藥理學(xué)和生理學(xué)的研究開辟了新途徑。研究發(fā)現(xiàn),G1作用于內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和腎素-血管緊張素系統(tǒng),產(chǎn)生舒張血管[10]、降低血壓[11]、抗炎[12]、防止心肌再灌注損傷[13]、緩解肺動(dòng)脈高壓[14]等心血管保護(hù)作用。
雖然GPER1具有潛在的心血管保護(hù)作用,但其在緩解心肌細(xì)胞肥大中的作用機(jī)制仍未闡明。本研究通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)蛋白質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)分析進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析,通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western-blot)和熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)技術(shù)探究其可能的調(diào)控機(jī)制。
材料與試劑: G1、G15(Cayman Chemical,美國(guó)),DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone,美國(guó)),胎牛血清(Gibico,美國(guó))、馬血清(BI,以色列),血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、抗GPER1抗體(Abcam,美國(guó)),抗絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)抗體、抗p-AKT抗體、抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)抗體、抗p-ERK抗體、抗LC3抗體和抗GAPDH抗體(CST,美國(guó)),二抗HRP(Proteintech,中國(guó)),Alexa Fluor 488抗體(Life Technologies,美國(guó)),4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DIPI,Thermo Fisher Scientific,美國(guó)),qRT-PCR試劑盒(TAKARA,日本)和流式試劑盒(BD,美國(guó))。
細(xì)胞培養(yǎng):2~3日齡的新生Wistar乳鼠50只(購(gòu)自山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)表皮消毒后,摘取心臟并剪碎成2~3 mm3的組織塊,胰蛋白酶(0.1%)重懸置于磁力攪拌器消化10 min。5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化,800 g離心10 min后收集細(xì)胞。DMEM高糖培養(yǎng)基(含有6%馬血清、8%新生牛血清和1%青霉素/鏈霉素),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h。
模型建立和分組:心肌細(xì)胞血清饑餓后,AngⅡ(0 、50 、100 和250 nmol/L)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。檢測(cè)信號(hào)通路檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為6組:空白對(duì)照組、AngⅡ 組、AngⅡ +G1組、AngⅡ +G1+G15組、AngⅡ+G1+ERK抑制劑 (U0126)組和AngⅡ+G1+AKT抑制劑 (MK2206)組??瞻讓?duì)照組不給藥;AngⅡ組給予AngⅡ(100 nmol/L)處理;AngⅡ+G1組給予AngⅡ(100 nmol/L)和G1(100 nmol/L)處理;AngⅡ+G1+G15組給予AngⅡ(100 nmol/L)、G1(100 nmol/L)和G15(100 nmol/L)處理;AngⅡ +G1+U0126組 給 予 AngⅡ(100 nmol/L)、G1(100 nmol/L) 和 U0126(100 nmol/L) 處 理;AngⅡ+G1+MK2206組給予AngⅡ(100 nmol/L)、G1(100 nmol/L)和 MK2206(5 μmol/L)處理。各組n=3。
蛋白質(zhì)譜分析:檢測(cè)空白對(duì)照組、AngⅡ(100 nmol/L)組和AngⅡ+G1(100 nmol/L)組的蛋白表達(dá)差異。用軟件Mascot2.5和Proteome Discoverer2.1,篩選出差異倍數(shù)>1.2,P<0.05的差異蛋白分子。
細(xì)胞免疫熒光染色:心肌細(xì)胞4%多聚甲醛固定20 min,0.5%Triton X-100細(xì)胞膜通透劑室溫通透20 min,血清封閉。GPER1抗體1:300稀釋4℃孵育過(guò)夜,PBST(PBS+Tween-20洗液,pH=7.4)浸洗后,熒光二抗避光孵育1 h,DAPI避光孵育10 min,鏡下觀察采集圖像。
Western-blot: 6 孔板加入 100 μl RIPA 裂解液和1%PMSF蛋白酶抑制劑裂解細(xì)胞,超聲粉碎,4℃12 000 g離心,取上清蛋白定量。25 μl 5 X loading buffer 混勻后100℃水浴,-80℃保存。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,90 V恒壓電泳,250 mA恒流轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,洗膜,抗體1:1 000稀釋4℃孵育過(guò)夜。TBST洗液漂洗后,二抗1:1 0000孵育1 h,漂洗后化學(xué)發(fā)光法顯色。
qRT-PCR檢測(cè): Trizol法提取總RNA后,按Takara試劑盒說(shuō)明書要求行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。所有引物購(gòu)自Takara公司,引物序列:心房鈉尿肽(ANP)上 游 引 物5'-CGTATACAGTGCGGTGTCCA-3',下 游 引 物 5'-GGTTGACTTCCCCAGTCCAG-3';B型 利 鈉 肽(BNP) 上 游 引 物5'-AGCTGCTGGAGCTGATAAGAG-3', 下 游 引 物5'-CTGCCCAAAGCAGCTTGAAC-3';GPER1 上 游 引物5'-CCATCATCGGCCTGTGCTAT-3',下游引物5'-GAAGACAAGGACCACTGCGA-3';GAPDH 上游引物5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′,下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示,組間比較用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
Ang Ⅱ(0、50、100 和 250 nmol/L)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞24 h。各組心肌細(xì)胞表面積分別為(1 343.6±202.9)μm2,(1 657.3±168.6)μm2,(2 603.1±381.7)μm2, (3 350.0±413.3)μm2。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果,與空白對(duì)照組相比,AngⅡ(100 nmol/L) 組的心肌細(xì)胞表面積明顯增大(P<0.01)。
圖1 細(xì)胞免疫熒光染色、蛋白免疫印跡法、熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1的表達(dá)
心肌細(xì)胞特異性免疫熒光(抗GPER1,綠光)染色結(jié)果顯示(圖1A),AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細(xì)胞GPER1蛋白表達(dá)均較空白對(duì)照組明顯增加。Western-blot結(jié)果顯示(圖1B),AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細(xì)胞GPER1蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組略有升高(P均<0.05),AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組對(duì)GPER1蛋白表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示(圖1C),AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細(xì)胞GPER1 mRNA水平均較空白對(duì)照組均明顯升高(P均<0.05)。
GPER1激活劑G1(10、100和1 000 nmol/L)和AngⅡ(100 nmol/L)共同作用于心肌細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,AngⅡ(100 nmol/L)組和AngⅡ+G1(10、100和1 000 nmol/L)組肥大心肌細(xì)胞ANP和BNP mRNA水平均明顯升高(P<0.01)。隨著G1濃度的升高,ANP和BNP mRNA水平基本呈梯度降低,尤其是AngⅡ+G1(100、1 000 nmol/L)組與AngⅡ(100 nmol/L)組相比ANP和BNP mRNA水平均明顯降低(P均<0.05)。
圖2 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)濃度梯度G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1激活劑對(duì)心肌細(xì)胞心房鈉尿肽(2A) 和B型利鈉肽信使核糖核酸(2B)的影響
蛋白質(zhì)譜分析顯示:空白對(duì)照組與AngⅡ組組間差異蛋白52種;AngⅡ組與AngⅡ+G1組組間差異蛋白36種。兩組間差異蛋白交叉存在的5種關(guān)鍵基因是Fam120b、RGD1562310、Ctrb1、Rap1gap和Pag1。與空白對(duì)照組相比,AngⅡ組的Rap1gap蛋白高表達(dá)(比值=1.348 98,P=0.033 99),而與AngⅡ組相比,AngⅡ+G 1組的Rap1gap蛋白表達(dá)又相對(duì)低表達(dá)(比值=0.743 79,P=0.017 02)。
Western-blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組或AngⅡ組相比,AngⅡ+G1組p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)均有顯著升高(P<0.01)。AngⅡ+G1+G15組與AngⅡ+G1組相比,p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)。AngⅡ+G1+U0126組與 AngⅡ +G1組相比,p-ERK蛋白表達(dá)水平降低(P均<0.01),而p-AKT蛋白表達(dá)水平無(wú)變化(P>0.05);AngⅡ+G1+MK2206組與AngⅡ+G1組相比,其p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)水平均有明顯降低(P均<0.01)。
圖3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)6組心肌細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸激酶(3A)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶蛋白磷酸化(3B)水平的影響
qRT-PCR結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比,AngⅡ組ANP和BNP mRNA水平均有顯著升高(P<0.01)。與AngⅡ組比,AngⅡ+G1組ANP和BNP mRNA水平均有明顯降低(P<0.01)。與 AngⅡ組或AngⅡ+G1組相比,AngⅡ+G1+MK2206組ANP和BNP mRNA水平均有明顯升高(P均<0.01)。
流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,空白對(duì)照組、AngⅡ組和AngⅡ+G1組的凋亡水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western-blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,AngⅡ組LC3II/LC3I增大(P<0.01);與AngⅡ組相比,AngⅡ+G1組LC3II/LC3I減?。≒<0.01)。與AngⅡ+G1組相比,AngⅡ+G1+G15組心肌細(xì)胞LC3II/LC3I比值升高(P<0.01)。
圖4 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑對(duì)心肌細(xì)胞心房鈉尿肽(4A)和B型利鈉肽信使核糖核酸(4B)水平的影響
圖5 蛋白免疫印跡檢測(cè)激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1對(duì)心肌細(xì)胞胞漿型自噬標(biāo)記輕鏈3和膜型自噬標(biāo)記輕鏈3表達(dá)的影響
女性健康指南(WHI)隨機(jī)控制試驗(yàn)和心臟雌激素重施(HERS)試驗(yàn)均未得出雌激素對(duì)心血管系統(tǒng)保護(hù)作用的支持性結(jié)論,并且絕經(jīng)期女性外源性雌激素替代治療可能增加女性生殖系統(tǒng)腫瘤[15],限制了臨床應(yīng)用雌激素來(lái)保護(hù)心肌的相關(guān)研究的開展。新型膜雌激素受體GPER1的發(fā)現(xiàn)為雌激素抗心血管疾病的研究帶來(lái)了新的希望。本研究主要探討激活GPER1快速信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)心肌細(xì)胞的影響。本研究通過(guò)免疫熒光染色,Western-blot和qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn),大鼠原代心肌細(xì)胞存在GPER1的表達(dá),這與De Francesco等[16]的研究結(jié)果是相互印證的。
緩解心肌細(xì)胞肥大是防止心臟肥厚進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵。ANP和BNP是重要的心臟神經(jīng)內(nèi)分泌激素,與心臟壓力負(fù)荷和容量負(fù)荷的增加有關(guān),其mRNA水平是衡量心肌肥厚和心力衰竭的重要指標(biāo)[17]。激活的GPER1能有效緩解心肌細(xì)胞肥大,該作用可被G15和MK2206阻斷。這就為雌激素替代療法提供了新的可能。單純激活GPER1既可以緩解細(xì)胞肥大,又相對(duì)之前的雌激素替代療法更加安全。
生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示Rap1gap蛋白分子下游的B-Raf/Raf-1-MEK-ERK信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和PI3K-AKT信號(hào)通路參與GPER1介導(dǎo)的心肌細(xì)胞調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路。ERK信號(hào)通路與細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄作用有關(guān),而AKT信號(hào)通路可能與心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、肥大和存活相關(guān)。本研究Western-blot結(jié)果顯示,AKT和ERK參與GPER1介導(dǎo)的抗心肌細(xì)胞肥大作用,且MK2206(AKT特異性抑制劑)可同時(shí)抑制p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)。這就說(shuō)明,PI3K-AKT信號(hào)通路和MEK-ERK信號(hào)通路可能存在交叉,AKT可能參與調(diào)控ERK的表達(dá)。
哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶(mTOR)作為AKT下游重要蛋白分子,是一種非典型AKT,可以影響基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)翻譯,參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等過(guò)程,與蛋白質(zhì)合成、免疫、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及代謝、細(xì)胞凋亡及自噬等均有聯(lián)系[18]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí),雷帕霉素能抑制心肌細(xì)胞肥大,肥大過(guò)程中蛋白質(zhì)合成的增加與AKT-mTOR信號(hào)通路的激活有關(guān),雷帕霉素和PI3K抑制劑均能抑制肥大過(guò)程中蛋白質(zhì)的合成[19]。細(xì)胞凋亡和自噬作為細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制,都有可能參與心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控。但本研究證實(shí),GPER1介導(dǎo)的抗心肌細(xì)胞肥大作用可能與細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān),而與細(xì)胞自噬相關(guān)。GPER1受體可能通過(guò)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)揮抗心肌細(xì)胞肥大作用。然而,自噬與mTOR通路之間的關(guān)系非常復(fù)雜,而且GPER1的激活mTOR的具體機(jī)制,以及TORC1和mTORC2的相互調(diào)節(jié)作用仍需要進(jìn)一步研究揭示。
我們目前的研究尚處于起始階段,對(duì)GPER1生物功能的理解還不夠深入,隨著研究的深入,GPER1的潛在致癌作用(特別是婦科癌癥,如卵巢癌[20]和乳腺癌[21])和心血管保護(hù)功能將逐漸被揭示。
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