裴慧，王立啟，王磊，王維，畢秀萍，才曉君，蘇國海，趙卓

內(nèi)源性雌激素對女性絕經(jīng)前心血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要的調(diào)節(jié)作用[1]，能延緩高血壓、心力衰竭和冠狀動脈疾病的發(fā)展。絕經(jīng)后雌激素替代療法對心血管疾病具有保護(hù)作用[2,3]。最初研究證實(shí)，雌激素主要通過經(jīng)典雌激素受體ERα和ERβ來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而保護(hù)心血管系統(tǒng)[4，5]。隨著研究的深入，G蛋白偶聯(lián)受體30（GPR30）作為雌激素受體的功能被發(fā)現(xiàn)[6]，國際藥理學(xué)聯(lián)合會（IUPHAR）也將GPR30或G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1（GPER1）分類為膜雌激素受體。

GPER1參與雌激素介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄和信號通路的調(diào)節(jié)[7]。GPER1主要通過快速非基因組機(jī)制參與雌激素信號的傳導(dǎo)，如細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng)中的鈣動員、激酶激活及一氧化氮產(chǎn)生等[8]。近年來，特異性GPER1激活劑G1（簡稱G1）[9]和抑制劑G15（簡稱G15）的合成，為其藥理學(xué)和生理學(xué)的研究開辟了新途徑。研究發(fā)現(xiàn)，G1作用于內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和腎素-血管緊張素系統(tǒng)，產(chǎn)生舒張血管[10]、降低血壓[11]、抗炎[12]、防止心肌再灌注損傷[13]、緩解肺動脈高壓[14]等心血管保護(hù)作用。

雖然GPER1具有潛在的心血管保護(hù)作用，但其在緩解心肌細(xì)胞肥大中的作用機(jī)制仍未闡明。本研究通過串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）蛋白質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)分析進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，通過蛋白免疫印跡法（Western-blot）和熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)探究其可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

材料與試劑： G1、G15（Cayman Chemical，美國），DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清（Gibico，美國）、馬血清（BI，以色列），血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、抗GPER1抗體（Abcam，美國），抗絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）抗體、抗p-AKT抗體、抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）抗體、抗p-ERK抗體、抗LC3抗體和抗GAPDH抗體（CST，美國），二抗HRP（Proteintech，中國），Alexa Fluor 488抗體（Life Technologies，美國），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DIPI,Thermo Fisher Scientific，美國），qRT-PCR試劑盒（TAKARA，日本）和流式試劑盒（BD，美國）。

細(xì)胞培養(yǎng)：2～3日齡的新生Wistar乳鼠50只（購自山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心）表皮消毒后，摘取心臟并剪碎成2～3 mm3的組織塊，胰蛋白酶（0.1%）重懸置于磁力攪拌器消化10 min。5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，800 g離心10 min后收集細(xì)胞。DMEM高糖培養(yǎng)基（含有6%馬血清、8%新生牛血清和1%青霉素/鏈霉素），培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h。

模型建立和分組：心肌細(xì)胞血清饑餓后，AngⅡ（0 、50 、100 和250 nmol/L）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。檢測信號通路檢測實(shí)驗(yàn)分為6組：空白對照組、AngⅡ 組、AngⅡ +G1組、AngⅡ +G1+G15組、AngⅡ+G1+ERK抑制劑 （U0126）組和AngⅡ+G1+AKT抑制劑 （MK2206）組。空白對照組不給藥；AngⅡ組給予AngⅡ（100 nmol/L）處理；AngⅡ+G1組給予AngⅡ（100 nmol/L）和G1（100 nmol/L）處理；AngⅡ+G1+G15組給予AngⅡ（100 nmol/L）、G1（100 nmol/L）和G15（100 nmol/L）處理；AngⅡ +G1+U0126組 給 予 AngⅡ（100 nmol/L）、G1（100 nmol/L） 和 U0126（100 nmol/L） 處 理；AngⅡ+G1+MK2206組給予AngⅡ（100 nmol/L）、G1（100 nmol/L）和 MK2206（5 μmol/L）處理。各組n=3。

蛋白質(zhì)譜分析：檢測空白對照組、AngⅡ（100 nmol/L）組和AngⅡ+G1（100 nmol/L）組的蛋白表達(dá)差異。用軟件Mascot2.5和Proteome Discoverer2.1，篩選出差異倍數(shù)＞1.2，P＜0.05的差異蛋白分子。

細(xì)胞免疫熒光染色：心肌細(xì)胞4%多聚甲醛固定20 min，0.5%Triton X-100細(xì)胞膜通透劑室溫通透20 min，血清封閉。GPER1抗體1:300稀釋4℃孵育過夜，PBST（PBS+Tween-20洗液，pH=7.4）浸洗后，熒光二抗避光孵育1 h，DAPI避光孵育10 min，鏡下觀察采集圖像。

Western-blot： 6 孔板加入 100 μl RIPA 裂解液和1%PMSF蛋白酶抑制劑裂解細(xì)胞，超聲粉碎，4℃12 000 g離心，取上清蛋白定量。25 μl 5 X loading buffer 混勻后100℃水浴，-80℃保存。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，90 V恒壓電泳，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，洗膜，抗體1:1 000稀釋4℃孵育過夜。TBST洗液漂洗后，二抗1:1 0000孵育1 h，漂洗后化學(xué)發(fā)光法顯色。

qRT-PCR檢測： Trizol法提取總RNA后，按Takara試劑盒說明書要求行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。所有引物購自Takara公司，引物序列：心房鈉尿肽（ANP）上 游 引 物5'-CGTATACAGTGCGGTGTCCA-3'，下 游 引 物 5'-GGTTGACTTCCCCAGTCCAG-3'；B型 利 鈉 肽（BNP） 上 游 引 物5'-AGCTGCTGGAGCTGATAAGAG-3'， 下 游 引 物5'-CTGCCCAAAGCAGCTTGAAC-3'；GPER1 上 游 引物5'-CCATCATCGGCCTGTGCTAT-3'，下游引物5'-GAAGACAAGGACCACTGCGA-3'；GAPDH 上游引物5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大

Ang Ⅱ（0、50、100 和 250 nmol/L）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞24 h。各組心肌細(xì)胞表面積分別為（1 343.6±202.9）μm2，（1 657.3±168.6）μm2，（2 603.1±381.7）μm2， （3 350.0±413.3）μm2。qRT-PCR檢測結(jié)果，與空白對照組相比，AngⅡ（100 nmol/L） 組的心肌細(xì)胞表面積明顯增大（P＜0.01）。

2.2 心肌細(xì)胞中存在G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1的表達(dá)（圖 1）

圖1 細(xì)胞免疫熒光染色、蛋白免疫印跡法、熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)監(jiān)測心肌細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1的表達(dá)

心肌細(xì)胞特異性免疫熒光（抗GPER1，綠光）染色結(jié)果顯示（圖1A），AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細(xì)胞GPER1蛋白表達(dá)均較空白對照組明顯增加。Western-blot結(jié)果顯示（圖1B），AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細(xì)胞GPER1蛋白表達(dá)水平均較空白對照組略有升高（P均＜0.05），AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組對GPER1蛋白表達(dá)無差異（P＞0.05）。qRT-PCR結(jié)果顯示（圖1C），AngⅡ組、AngⅡ+G1組和AngⅡ+G15組肥大心肌細(xì)胞GPER1 mRNA水平均較空白對照組均明顯升高（P均＜0.05）。

2.3 激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1可以降低心肌細(xì)胞心房鈉尿肽和B型利鈉肽信使核糖核酸水平（圖2）

GPER1激活劑G1（10、100和1 000 nmol/L）和AngⅡ（100 nmol/L）共同作用于心肌細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組相比，AngⅡ（100 nmol/L）組和AngⅡ+G1（10、100和1 000 nmol/L）組肥大心肌細(xì)胞ANP和BNP mRNA水平均明顯升高（P＜0.01）。隨著G1濃度的升高，ANP和BNP mRNA水平基本呈梯度降低，尤其是AngⅡ+G1（100、1 000 nmol/L）組與AngⅡ（100 nmol/L）組相比ANP和BNP mRNA水平均明顯降低（P均＜0.05）。

圖2 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測濃度梯度G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1激活劑對心肌細(xì)胞心房鈉尿肽（2A） 和B型利鈉肽信使核糖核酸（2B）的影響

2.4 各組乳鼠心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析

蛋白質(zhì)譜分析顯示：空白對照組與AngⅡ組組間差異蛋白52種；AngⅡ組與AngⅡ+G1組組間差異蛋白36種。兩組間差異蛋白交叉存在的5種關(guān)鍵基因是Fam120b、RGD1562310、Ctrb1、Rap1gap和Pag1。與空白對照組相比，AngⅡ組的Rap1gap蛋白高表達(dá)（比值=1.348 98，P=0.033 99），而與AngⅡ組相比，AngⅡ+G 1組的Rap1gap蛋白表達(dá)又相對低表達(dá)（比值=0.743 79，P=0.017 02）。

2.5 激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1參與調(diào)控心肌細(xì)胞的信號通路（圖3）

Western-blot結(jié)果顯示，與空白對照組或AngⅡ組相比，AngⅡ+G1組p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)均有顯著升高（P＜0.01）。AngⅡ+G1+G15組與AngⅡ+G1組相比，p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05）。AngⅡ+G1+U0126組與 AngⅡ +G1組相比，p-ERK蛋白表達(dá)水平降低（P均＜0.01），而p-AKT蛋白表達(dá)水平無變化（P＞0.05）；AngⅡ+G1+MK2206組與AngⅡ+G1組相比，其p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)水平均有明顯降低（P均＜0.01）。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測6組心肌細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸激酶（3A）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶蛋白磷酸化（3B）水平的影響

2.6 G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1參與緩解心肌細(xì)胞肥大可能主要與絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路有關(guān)（圖4）

qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組比，AngⅡ組ANP和BNP mRNA水平均有顯著升高（P＜0.01）。與AngⅡ組比，AngⅡ+G1組ANP和BNP mRNA水平均有明顯降低（P＜0.01）。與 AngⅡ組或AngⅡ+G1組相比，AngⅡ+G1+MK2206組ANP和BNP mRNA水平均有明顯升高（P均＜0.01）。

2.7 激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1對心肌細(xì)胞凋亡和自噬的影響（圖5）

流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，空白對照組、AngⅡ組和AngⅡ+G1組的凋亡水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Western-blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，AngⅡ組LC3II/LC3I增大（P＜0.01）；與AngⅡ組相比，AngⅡ+G1組LC3II/LC3I減小（P＜0.01）。與AngⅡ+G1組相比，AngⅡ+G1+G15組心肌細(xì)胞LC3II/LC3I比值升高（P＜0.01）。

圖4 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑對心肌細(xì)胞心房鈉尿肽（4A）和B型利鈉肽信使核糖核酸（4B）水平的影響

圖5 蛋白免疫印跡檢測激活G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1對心肌細(xì)胞胞漿型自噬標(biāo)記輕鏈3和膜型自噬標(biāo)記輕鏈3表達(dá)的影響

3 討論

女性健康指南（WHI）隨機(jī)控制試驗(yàn)和心臟雌激素重施（HERS）試驗(yàn)均未得出雌激素對心血管系統(tǒng)保護(hù)作用的支持性結(jié)論，并且絕經(jīng)期女性外源性雌激素替代治療可能增加女性生殖系統(tǒng)腫瘤[15]，限制了臨床應(yīng)用雌激素來保護(hù)心肌的相關(guān)研究的開展。新型膜雌激素受體GPER1的發(fā)現(xiàn)為雌激素抗心血管疾病的研究帶來了新的希望。本研究主要探討激活GPER1快速信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對心肌細(xì)胞的影響。本研究通過免疫熒光染色，Western-blot和qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，大鼠原代心肌細(xì)胞存在GPER1的表達(dá)，這與De Francesco等[16]的研究結(jié)果是相互印證的。

緩解心肌細(xì)胞肥大是防止心臟肥厚進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵。ANP和BNP是重要的心臟神經(jīng)內(nèi)分泌激素，與心臟壓力負(fù)荷和容量負(fù)荷的增加有關(guān)，其mRNA水平是衡量心肌肥厚和心力衰竭的重要指標(biāo)[17]。激活的GPER1能有效緩解心肌細(xì)胞肥大，該作用可被G15和MK2206阻斷。這就為雌激素替代療法提供了新的可能。單純激活GPER1既可以緩解細(xì)胞肥大，又相對之前的雌激素替代療法更加安全。

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示Rap1gap蛋白分子下游的B-Raf/Raf-1-MEK-ERK信號通路、MAPK信號通路和PI3K-AKT信號通路參與GPER1介導(dǎo)的心肌細(xì)胞調(diào)控的關(guān)鍵信號通路。ERK信號通路與細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄作用有關(guān)，而AKT信號通路可能與心肌細(xì)胞的生長、肥大和存活相關(guān)。本研究Western-blot結(jié)果顯示，AKT和ERK參與GPER1介導(dǎo)的抗心肌細(xì)胞肥大作用，且MK2206（AKT特異性抑制劑）可同時(shí)抑制p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)。這就說明，PI3K-AKT信號通路和MEK-ERK信號通路可能存在交叉，AKT可能參與調(diào)控ERK的表達(dá)。

哺乳動物的雷帕霉素靶（mTOR）作為AKT下游重要蛋白分子，是一種非典型AKT，可以影響基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)翻譯，參與調(diào)控細(xì)胞生長、增殖等過程，與蛋白質(zhì)合成、免疫、細(xì)胞運(yùn)動及代謝、細(xì)胞凋亡及自噬等均有聯(lián)系[18]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雷帕霉素能抑制心肌細(xì)胞肥大，肥大過程中蛋白質(zhì)合成的增加與AKT-mTOR信號通路的激活有關(guān)，雷帕霉素和PI3K抑制劑均能抑制肥大過程中蛋白質(zhì)的合成[19]。細(xì)胞凋亡和自噬作為細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，都有可能參與心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控。但本研究證實(shí)，GPER1介導(dǎo)的抗心肌細(xì)胞肥大作用可能與細(xì)胞凋亡無關(guān)，而與細(xì)胞自噬相關(guān)。GPER1受體可能通過PI3K-AKT-mTOR信號通路介導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)揮抗心肌細(xì)胞肥大作用。然而，自噬與mTOR通路之間的關(guān)系非常復(fù)雜，而且GPER1的激活mTOR的具體機(jī)制，以及TORC1和mTORC2的相互調(diào)節(jié)作用仍需要進(jìn)一步研究揭示。

我們目前的研究尚處于起始階段，對GPER1生物功能的理解還不夠深入，隨著研究的深入，GPER1的潛在致癌作用（特別是婦科癌癥，如卵巢癌[20]和乳腺癌[21]）和心血管保護(hù)功能將逐漸被揭示。

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