李文超，梁啟超，鞏麗虹，倪丹蓉，汪洋，馮林旭，張朝立，高長久*

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.焦作市人民醫(yī)院，河南 焦作 454150)

蘆竹根Arundo Donax Rhizoma[1]，又名蘆荻頭、樓梯桿，為禾本科蘆竹屬植物蘆竹ArundodonaxL.的新鮮或干燥根莖，其入藥首載于《嶺南采藥錄》。蘆竹為蘆竹根的原植物，又名荻蘆竹(《本草匯言》)、綠竹(《分類草藥性》)，是一種全球分布較廣的植物，其資源豐富，廣泛分布于亞洲、歐洲南部、非洲北部以及中東地區(qū)。我國主要分布于西南、華南及江蘇、浙江、湖南等地。我國蘆竹多用于造紙工業(yè)[2]。蘆竹在歐洲與印度等地被用作結(jié)瘢劑、止血藥、回乳劑、止瀉藥、利尿藥，或用于治療牙疼、支氣管炎等[3-6]，藥用價(jià)值顯著。

蘆竹根微苦、味甘，性寒，具有清熱瀉火、止嘔生津、利尿通淋的功能[7]，主治熱病發(fā)狂、虛勞骨蒸、小便不利、淋病、風(fēng)火牙痛等癥。臨床上主要用于治療小兒上呼吸道感染引起的高熱癥，療效確切，為中藥制劑蘆黃沖劑和去感熱注射液的主要原料藥材。蘆竹根主要化學(xué)成分為多種吲哚類生物堿，有降壓解痙作用，能拮抗組織胺、5-羥色胺、乙酰膽堿引起的痙攣[8-9]。因此，蘆竹根有較好的藥用開發(fā)價(jià)值。目前，國內(nèi)外主要報(bào)道了蘆竹根中生物堿的提取分離、結(jié)構(gòu)分析[10-12]等研究。K.A.Ubaidullaev等[13]對塔吉克斯坦的Shaartuz地區(qū)的蘆竹根地上部分采用三氯甲烷進(jìn)行提取，反復(fù)氧化鋁柱層析分離得到3種吲哚類生物堿donaxine、donaxaridine和donaxarine，經(jīng)紅外光譜法、紫外光譜、質(zhì)譜和核磁共振法對donaxaridine和donaxarine結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定。V.U.Khuzhaev等[14]對烏茲別克斯坦首都塔什干科學(xué)院植物園內(nèi)的蘆竹根采用三氯甲烷提取，同樣氧化鋁柱層析發(fā)現(xiàn)了之前得到的雙吲哚生物堿arundine(donaxine)，并采用紅外光譜法、紫外光譜、質(zhì)譜和核磁共振法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定，同時(shí)對其進(jìn)行了合成。我國對蘆竹根的藥用研究一直滯后于國外，急需對其進(jìn)行系統(tǒng)而深入的研究。2016年，劉清茹等[15]對蘆竹根的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，采用不同色譜技術(shù)和重結(jié)晶等方法分離純化湖南瀏陽產(chǎn)蘆竹根化學(xué)成分，并通過理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。從其70%乙醇提取物中分離得到23個(gè)化合物。本實(shí)驗(yàn)研究蘆竹根總生物堿的提取工藝，以期提高實(shí)際生產(chǎn)中的產(chǎn)率問題，為其市場開發(fā)創(chuàng)造條件。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Cary100雙光束紫外-可見分光光度儀(美國瓦里安公司)；AX200型電子天平(日本島津)；R205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物科技有限公司)。

1.2 材料

蘆竹根藥材購自四川省成都市，經(jīng)牡丹江市牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院高長久老師鑒定為蘆竹的根。

蘆竹堿對照品(沃凱，純度>97%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20130419)；乙醇、三氯甲烷、氫氧化鈉、鹽酸、濃氨水(均市售分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆竹根藥材中總生物堿的含量測定

2.1.1 對照品儲備液的制備 取蘆竹堿對照品約50 mg，精密稱定，置250 mL量瓶中，加入乙醇至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.198 mg·mL-1對照品儲備液。

2.1.2 測定波長的選擇 以乙醇為空白對照，將對照品溶液、樣品供試液和空白對照液在200～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，前兩者在210 nm和280 nm左右均有最大吸收，且在280 nm處吸收峰峰形較好，空白對照液在280 nm處幾乎沒有吸收，故本實(shí)驗(yàn)選擇280 nm為測定波長，結(jié)果見圖1。

注：a.蘆竹堿對照品；b.供試品；c.空白溶液。圖1 波長掃描圖

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于10 mL容量瓶，乙醇定容至刻度。以乙醇為空白于280 nm測定吸光度值。以蘆竹堿對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程：Y=0.002 66+36.147 72X，r=0.999 9(n=8)，蘆竹堿在0.02～0.28 mg·mL-1與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 總生物堿的提取

將蘆竹根藥材粗粉100 g，加水浸泡2 h，煎煮1 h，紗布過濾，藥渣再煎煮一次。合并水煎液并濃縮，用乙醇調(diào)至含醇80%進(jìn)行醇沉，靜置，過夜。抽濾，濾液濃縮以回收乙醇。醇浸膏用濃氨水堿化至pH 10以上，用三氯甲烷萃取2～3次。合并三氯甲烷層并將三氯甲烷層移入250 mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，即得供試液。吸取供試液5.0 mL于干燥的250 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，以無水乙醇為參比，在280 nm處測定吸光度。

2.3 總生物堿含量的測定

精密量取不同批次蘆竹根總生物堿提取物3份，按2.1.1的方法制備樣品溶液和空白對照液，在280 nm處分別測定吸光度并計(jì)算其總生物堿平均含量。

2.4 總生物堿提取的單因素試驗(yàn)考察

2.4.1 含醇量的確定 稱取100 g粗粉，每次煎煮1 h，7倍液量，煎煮2次，過濾，收集濾液。將總濾液分成6等份濃縮，分別使溶液含醇量至90%、80%、70%、60%、40%、30%，制得供試品溶液。定容25 mL容量瓶中，精密量取0.15 mL樣品溶液，移至25 mL比色管中，無水乙醇定容，搖勻。在280 nm波長處測定吸光度值。

2.4.2 提取時(shí)間的確定 稱取100 g粗粉6份，煎煮2次，7倍液量，含醇量80%，分別煎煮0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h共制得供試品溶液6份。定容25 mL容量瓶中，精密量取0.15 mL樣品溶液，移至25 mL比色管中，無水乙醇定容，搖勻。在280 nm波長處測定吸光度值。

2.4.3 提取次數(shù)的確定 稱取100 g粗粉，每次煎煮1 h，7倍液量，含醇量80%，煎煮1次后，連續(xù)煎煮上次濾渣，煎煮4次，制得供試品溶液。定容25 mL容量瓶中，精密量取0.15 mL樣品溶液，移至25 mL比色管中，無水乙醇定容，搖勻。在280 nm波長處測定吸光度值。

2.4.4 提取液體積的確定 稱取100 g粗粉5份，每次煎煮1 h，煎煮2次，含醇量80%，分別在提取液體積5倍、6倍、7倍、8倍、9倍(如500 mL一定濃度的乙醇每100 g藥材)條件下，制得樣品溶液。定容25 mL容量瓶中，精密量取0.15 mL樣品溶液，移至25 mL比色管中，無水乙醇定容，搖勻。在280 nm波長處測定吸光度值。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了確定蘆竹根總生物堿的最佳提取工藝，根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果選取液料比(A)、煎煮次數(shù)(B)、煎煮時(shí)間(C)、含醇量(D)為考察因素，以總生物堿含量為考察指標(biāo)，采取L9(34)正交表試驗(yàn)探索最佳試驗(yàn)條件。各因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)考察結(jié)果與分析

3.1.1 含醇量的確定 由圖1可知，蘆竹根總生物堿測定的吸光度值與含醇量的高低有著密切關(guān)系。當(dāng)含醇量增大時(shí)，總生物堿提取率隨之提高，當(dāng)含醇量高于80%提取率趨于平緩，實(shí)際操作過程中在含醇量80%左右時(shí)，易于萃取，分離層明顯。

圖2 不同醇沉含醇量提取比較

3.1.2 提取時(shí)間的確定 由圖2可知，蘆竹根總生物堿測定的吸光度值與煎煮時(shí)間的長短有關(guān)系。蘆竹根總生物堿提取率隨著時(shí)間延長而增大，當(dāng)煎煮時(shí)間在1.5 h后，曲線上升趨于平緩。因此煎煮時(shí)間1.5～3.0 h在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)。

圖3 不同煎煮時(shí)間提取比較

3.1.3 提取次數(shù)的確定 由圖3可知，蘆竹根總生物堿測定的吸光度值與提取次數(shù)有關(guān)系。在4次提取過程中，吸光度值隨著次數(shù)的增加而減少，在第三、第四次提取時(shí)，吸光度值變化很小，說明總生物堿已完全提取出來。

圖4 煎煮次數(shù)對含量的影響

3.1.4 提取液體積的確定 由圖4可知，蘆竹根總生物堿測定的吸光度值與液料比有關(guān)系。蘆竹根總生物堿的提取率隨著提取液的增加而增加，當(dāng)液料比6以上時(shí)，液料比對提取蘆竹根總生物堿的影響較小，在一定體積的溶劑已將有效成分基本溶出完全。

圖5 提取液體積對含量的影響

3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

3.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果 為了確定蘆竹根總生物堿的最佳提取工藝，根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果選取料液比(A)、煎煮次數(shù)(B)、煎煮時(shí)間(C)、醇沉含醇量(D)為考察因素，以總生物堿含量為考察指標(biāo)，采取L9(34)正交表探索最佳試驗(yàn)條件。蘆竹根總生物堿提取工藝條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果見表2。

表2 蘆竹根總生物堿提取工藝條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

由直觀分析可知，以蘆竹根總生物堿的提取含量為考察指標(biāo)，表2中R值可以看出，各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響大小順序?yàn)镈>C>B>A，即醇沉含醇量>煎煮時(shí)間>煎煮次數(shù)>液料比，A最佳條件為A2，即液料比為7∶1。以影響最小的液料比為誤差項(xiàng)，進(jìn)行三因素方差分析，分析結(jié)果見表3。

表3 蘆竹根總生物堿提取率方差分析

注：F0.10(2，2)=9.00。

3.2.2 正交試驗(yàn)方差分析及其結(jié)果 由表3正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果得出，D因素的影響有顯著性意義，B和C因素則無顯著性影響。D最佳條件為D1(90%含醇量)。結(jié)合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定蘆竹根最佳提取工藝為A2B2C2D1，即液料比為7∶1；煎煮次數(shù)為3次；煎煮時(shí)間2 h；含醇量為90%。從極差、方差和實(shí)際操作過程中含醇量80%時(shí)，萃取效果最好，分層明顯，乳化現(xiàn)象少，且可以節(jié)省很多乙醇，為實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本。煎煮2次即可達(dá)到目的，減少能源消耗。綜合分析結(jié)果可以得出，最佳提取工藝為液料比7∶1、含醇量80%、煎煮時(shí)間2 h、煎煮次數(shù)2次。

3.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 分別取3份蘆竹根100 g，按最佳工藝條件平行操作，液料比7∶1、含醇量80%、煎煮時(shí)間2 h、煎煮次數(shù)2次。合并提取液，過濾，濃縮，定容。測定并計(jì)算3份蘆竹根中總生物堿的含量。結(jié)果見表4。

表4 最佳工藝條件驗(yàn)證結(jié)果

由表4得知，用最佳工藝條件提取，提取率高于正交試驗(yàn)中最高一組數(shù)據(jù)，所以這組最佳工藝條件合理。

4 討論

蘆竹根化學(xué)成分主要為多種吲哚類生物堿，有著較好的藥物開發(fā)價(jià)值。本文采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化水煎法提取蘆竹根中總生物堿的工藝。通過正交試驗(yàn)直觀分析得到各因素對蘆竹根中總生物堿提取影響的大小順序D>C>B>A，即含醇量>煎煮時(shí)間>煎煮次數(shù)>液料比。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果得出，D因素的影響有顯著性意義，D最佳條件為D1。結(jié)合直觀分析和方差分析結(jié)果，以及試驗(yàn)具體過程和節(jié)約生產(chǎn)成本考慮，確定蘆竹根中總生物堿最佳提取工藝為A2B2C2D1，即液料比為7∶1；煎煮次數(shù)為3次；煎煮時(shí)間2 h；含醇量為80%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)用最佳工藝條件提取，提取物得到的提取率高于正交試驗(yàn)中最高一組數(shù)據(jù)，所以這組最佳工藝條件合理。本試驗(yàn)所得到的工藝條件可行性強(qiáng)、工藝簡單，能為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)，為蘆竹資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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