李開言，張飛，田萍，馬開，王艷艷，李鳴，王軍*

(1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008)

野薔薇根(Rosa multiflora Thunb)，是薔薇科Rosaceae薔薇屬Rosa植物多花薔薇的干燥根皮。其藥性苦、澀、寒，無毒；歸脾、胃、腎經(jīng)；是清熱、燥濕、活血的收斂藥。具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、活血調(diào)經(jīng)、固精縮尿、消骨鯁等功能。研究發(fā)現(xiàn)，野薔薇中總黃酮含量豐富，尤其是根皮中含量最高[1]。研究文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，野薔薇及其變種中含有二氫黃酮(醇)[2]、山柰酚[3]、槲皮素[4]、二氫槲皮素[5]、蘆丁[4]、兒茶精[1]、金絲桃苷[6]、查耳酮[7]等豐富的黃酮類成分，這些成分具有抗氧化、降血脂、抑制血栓形成等治療動(dòng)脈粥樣硬化的功能。在臨床上利用其注射液治療高血脂并伴有高血壓癥的患者，有明顯的降血脂、降血壓功能[8]。大量的體內(nèi)外研究也發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有良好的改善心腦血管疾病的療效[9]。本實(shí)驗(yàn)主要是探究野薔薇根總黃酮的提取純化工藝，為今后的藥物開發(fā)做準(zhǔn)備。

大孔吸附樹脂具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且孔徑與比表面積都比較大，是一種高分子聚合物，不溶于水、酸、堿及乙醇、丙酮、烴類等有機(jī)溶劑，具有較高的耐酸、耐堿、耐氧化能力，對(duì)熱穩(wěn)定性強(qiáng)[10]。不同極性和含不同官能團(tuán)的樹脂對(duì)各類化合物的吸附解吸能力不同，因此需要根據(jù)有效成分純化的要求，選擇不同型號(hào)的樹脂[11]。大孔吸附樹脂具有價(jià)格低廉、可再生利用、操作簡單、對(duì)有機(jī)成分選擇性較高、吸附性能好等優(yōu)點(diǎn)，適合于中藥和天然藥物中有效成分的分離、純化，對(duì)促進(jìn)中藥現(xiàn)代化具有重要的作用[12]。

1 儀器與試藥

紫外分析儀UV-265FS(SHIMADZU)；超聲波清洗器SB-5200DT(寧波新芝生物科技股份有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000(鞏義市英峪高科儀器廠)；循環(huán)水真空泵SHB-Ⅲ型(鞏義市英欲儀器廠)；低溫冷卻循環(huán)泵DLSB-5/20 ℃(鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；萬分之一天平L-160DTP(LIBROR)。

野薔薇根購于安徽亳州藥材市場，粉碎，過60目篩。

蘆丁(HPLC≥98%，上海哈靈生物科技有限公司)；HP-20、HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-500、HPD-600、HPD-722、HPD-826、AB-8、D-101、D-140、D-301、DM-130、NKA-900大孔樹脂(勤實(shí)科技)；所用試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

試用70%乙醇溶液作為提取劑，對(duì)野薔薇根粉末進(jìn)行提取，過濾，乙醇溶液回收，濃縮至浸膏狀，于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1 黃酮的定性鑒別

鹽酸-鎂粉實(shí)驗(yàn)、三氯化鋁實(shí)驗(yàn)、濃氨水實(shí)驗(yàn)均呈現(xiàn)陽性，故可判定野薔薇根提取物中含有黃酮類化合物。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取于180 ℃干燥至恒重的無水蘆丁4.43 mg，用70%乙醇溶液溶解并定容于10 mL容量瓶中，超聲混合均勻，便制得蘆丁對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 吸收波長的選擇 分別取適量對(duì)照品溶液和野薔薇根醇提液，再依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，靜置6 min；10%硝酸鋁溶液0.4 mL，靜置6 min；1 mol·L-1氫氧化鈉溶液4 mL，靜置15 min；70%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻。在400～800 nm波長范圍掃描，對(duì)照品和野薔薇根醇提物最大吸收波長分別為508.0、498.6 nm，見圖1。以對(duì)照品最大吸收波長為準(zhǔn)，最終選擇檢測(cè)波長為508 nm。

圖1 400～800 nm紫外吸收光譜圖

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取不同體積蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，按照2.2.2步驟中10 mL反應(yīng)體系配制溶液，于508 nm處用紫外分光光度法測(cè)定各濃度的吸光度。

表1 不同質(zhì)量濃度蘆丁對(duì)照品溶液的吸光度測(cè)定

以蘆丁對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程：Y=7.804X+0.180 4，r=0.999 5。

2.3 野薔薇根總黃酮的粗提取

2.3.1 提取條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在進(jìn)行野薔薇根總黃酮回流提取時(shí)，保持沸騰溫度95 ℃，考察野薔薇根總黃酮提取時(shí)乙醇溶液的濃度、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計(jì)(見表2)，以野薔薇根中總黃酮的含量(檢測(cè)方法如2.2.2)和收膏率(將各組提取液移至已干燥稱重的蒸發(fā)皿中水浴蒸干，迅速置干燥器中放冷，稱重，計(jì)算干膏重量)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，公式(1)計(jì)算總黃酮含量，公式(2)計(jì)算收膏率，來選擇最適提取條件(見表3)。

總黃酮含量(%)=CVn/1000 m

(1)

收膏率(%)=(干膏質(zhì)量/生藥質(zhì)量)×100%

(2)

式中：C為樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度g·L-1；V為提取液稀釋定容體積mL；n為稀釋倍數(shù)；m是野薔薇根生藥粉末的質(zhì)量g。

表2 野薔薇根總黃酮提取工藝因素水平

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

注：D為空白組； K1、K2、K3為每個(gè)因素各個(gè)水平下的指標(biāo)總和；R為極差=平均含量最大值-平均含量最小值。

通過表3直觀分析可知，以總黃酮含量和收膏率為指標(biāo)，各因素影響程度均為A>B>C，A的影響最大。提取條件為組合A1B3C3時(shí)，總黃酮含量49.056%，收膏率11.41%；提取條件為組合A1B2C2時(shí)，總黃酮含量為47.219%(略低于49.056%)，收膏率12.85%(略高于11.41%)；考慮到組合A1B2C2的成本較低，提取時(shí)間較短，乙醇溶劑用量較少，方便后期的濃縮處理，故選擇組合A1B2C2為野薔薇根總黃酮最佳提取條件。在正交試驗(yàn)前已做過乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間的單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用溶劑為體積分?jǐn)?shù)30%、40%乙醇提取野薔薇根得到的總黃酮含量(42.107%、37.804%)均低于50%乙醇提取的總黃酮含量(48.936%)；料液比1∶20(49.036 %)比料液比1∶15(48.936%)得到的總黃酮含量略高，但成本增加較多；提取時(shí)間2.5 h(49.107%)與提取時(shí)間2 h(48.936%)得到的總黃酮含量基本相同，但提取時(shí)間3 h得到的總黃酮含量(44.209%)下降，可能是持續(xù)高溫提取破壞了部分溶劑中的黃酮。

2.3.2 粗提取 稱取1 kg藥材粉末，按照2.3.1最佳提取條件提取3次，藥液經(jīng)過濾后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行乙醇回收，濃縮成浸膏，放冰箱中4 ℃封口保存，以備用。

2.4 野薔薇根總黃酮的純化

2.4.1 大孔樹脂的篩選

2.4.1.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸 將14種大孔樹脂分別用95%的乙醇浸泡12 h，充分溶脹后各準(zhǔn)確稱取1.00 g，加入一定濃度的野薔薇根總黃酮提取液30 mL，靜置吸附24 h，測(cè)定未吸附藥液中總黃酮濃度。小心傾掉未吸附的藥液，用大量去離子水洗至澄清，淋干。加入40 mL 50%乙醇溶液，置于搖床上60 r·min-1解吸4 h，測(cè)定解吸液中總黃酮濃度，結(jié)果見表4。

吸附量=上樣液濃度×上樣液體積-流出液濃度×流出液體體積

(3)

(4)

(5)

綜合野薔薇根總黃酮的靜態(tài)吸附率和解吸率，從中篩選出HPD-400、HPD-600、HPD-826、DM-130型號(hào)的大孔樹脂來進(jìn)一步選擇。

表4 靜態(tài)吸附率、解吸率的測(cè)定

2.4.1.2 動(dòng)態(tài)解吸能力的考察 采用動(dòng)態(tài)吸附法，通過測(cè)定洗脫液中總黃酮的含量來計(jì)算解吸率以篩選出最合適的樹脂型號(hào)。分別準(zhǔn)確稱取已充分溶脹的HPD-400、HPD-600、HPD-826、DM-130型大孔吸附樹脂5.00 g，濕法裝柱，用大量去離子水沖洗至無醇味，備用。分別加入50 mL藥液上樣，當(dāng)藥液沒過樹脂約一指時(shí)，關(guān)閉止水夾，靜置2 h。用大量去離子水進(jìn)行水洗除雜，直至流出液澄清透明無顏色。再各加入40 mL 50%乙醇(相當(dāng)于5倍柱體積)溶液洗脫，流出液定容至40 mL，UV508 nm檢測(cè)流出液中總黃酮含量，結(jié)果如表5。

表5 動(dòng)態(tài)解吸液總黃酮含量的測(cè)定

綜合靜態(tài)吸附、解吸和動(dòng)態(tài)解吸能力的考察，選用HPD-400型號(hào)的大孔吸附樹脂為最佳純化樹脂柱。

2.4.2 野薔薇根總黃酮純化因素考察

2.4.2.1 上樣濃度的考察 取浸膏37.5 g，去離子水溶至250 mL，過濾配成母液。母液分別稀釋為1倍、1.5倍、2倍、2.5倍各原液。濕法裝柱，用大量去離子水沖洗至無醇味。準(zhǔn)確量取各原液40 mL上樣，UV508 nm檢測(cè)各原液和未吸附液吸光度，見表6。

表6 上樣濃度的考察測(cè)定

綜合對(duì)不同濃度藥液中總黃酮吸附率的考察，可知稀釋1.5倍的濃度是最佳上樣濃度。

2.4.2.2 最大上樣量的考察 將母液稀釋為1.5倍的原液，備用。分別準(zhǔn)確量取原液25、30、35、40 mL上樣，UV508 nm檢測(cè)不同體積原液上樣后未吸附液吸光度，見表7。

表7 最大上樣量的考察測(cè)定

注：“—”為原液不經(jīng)純化處理。

綜合不同上樣體積時(shí)藥液中總黃酮吸附率的考察，可知35 mL是最大上樣量。

2.4.2.3 上樣流速的考察 準(zhǔn)確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速分別為1.5、2、3、6 s/滴，UV508 nm檢測(cè)不同流速狀態(tài)下未吸附液吸光度，見表8。

表8 上樣流速的考察測(cè)定

注：“—”為原液不經(jīng)純化處理。

綜合不同上樣流速時(shí)藥液中總黃酮吸附率及效率的考察，可知3 s/滴是最佳上樣流速。

2.4.2.4 除雜用水量的考察 準(zhǔn)確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當(dāng)藥液沒過樹脂約一指時(shí)，關(guān)閉止水夾，靜置2 h。然后分別用24、32、40、48 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子。UV508 nm檢測(cè)不同體積去離子水除雜物中總黃酮吸光度，見表9。

表9 除雜用水量的考察測(cè)定

注：“—”為原液不經(jīng)純化處理。

綜合對(duì)不同體積去離子水除雜時(shí)廢液中總黃酮含量的考察，可知使用40 mL去離子水有除雜的最好效果。

2.4.2.5 洗脫液濃度的考察 準(zhǔn)確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當(dāng)藥液沒過樹脂約一指時(shí)，關(guān)閉止水夾，靜置2 h。然后用40 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子，再分別用40%、50%、60%、70%的乙醇溶液洗脫。UV508 nm檢測(cè)不同濃度洗脫液中總黃酮吸光度，見表10。

表10 洗脫液濃度的考察測(cè)定

注：“—”為原液不經(jīng)純化處理。

綜合對(duì)不同濃度乙醇進(jìn)行洗脫時(shí)洗脫液中總黃酮含量的考察，可知50%乙醇溶液為最佳洗脫液濃度。

2.4.2.6 洗脫液用量的考察 準(zhǔn)確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當(dāng)藥液沒過樹脂約一指時(shí)，關(guān)閉止水夾，靜置2 h。然后用40 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子，再用50%的乙醇溶液各24、32、40、48 mL進(jìn)行洗脫。UV508 nm檢測(cè)不同濃度洗脫液中總黃酮吸光度，見表11。

表11 洗脫液用量的考察測(cè)定

注：“—”為原液不經(jīng)純化處理。

綜合對(duì)不同體積50%乙醇溶液進(jìn)行洗脫時(shí)洗脫液中總黃酮含量的考察，可知32 mL 50%乙醇溶液為最佳洗脫液用量。

2.4.2.7 洗脫速率的考察 準(zhǔn)確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當(dāng)藥液沒過樹脂約一指時(shí)，關(guān)閉止水夾，靜置2 h。然后用40 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子，再分別控制用32 mL 50%的乙醇溶液1.5、2、3、6 s/滴的速度進(jìn)行洗脫。UV508 nm檢測(cè)不同流速狀態(tài)下洗脫液中總黃酮吸光度，見表12。

表12 洗脫液流速的考察測(cè)定

綜合對(duì)32 mL 50%乙醇溶液不同流速進(jìn)行洗脫時(shí)洗脫液中總黃酮含量的考察，可知2 s/滴為最佳洗脫液速率。

2.4.2.8樹脂重復(fù)使用次數(shù)的考察 準(zhǔn)確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當(dāng)藥液沒過樹脂約一指時(shí)，關(guān)閉止水夾，靜置2 h。然后用40 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子，再用50%的乙醇溶液32 mL進(jìn)行洗脫，流速為2 s/滴。UV508 nm檢測(cè)未吸附液中總黃酮及洗脫液中總黃酮吸光度，柱子重復(fù)4次使用，見表13。

表13 樹脂重復(fù)使用次數(shù)的考察測(cè)定

綜合對(duì)樹脂重復(fù)使用次數(shù)的考察數(shù)據(jù)，知樹脂可以重復(fù)使用3次，第4次使用吸附性能下降。

2.4.2.9 純化工藝的驗(yàn)證 準(zhǔn)確量取原液35 mL上樣，控制上樣流速為3 s/滴，當(dāng)藥液沒過樹脂約一指時(shí)，關(guān)閉止水夾，靜置2 h。然后用40 mL去離子水按1 s/滴沖洗柱子，再用50%的乙醇溶液32 mL進(jìn)行洗脫，流速為2 s/滴。UV508 nm檢測(cè)未吸附液中總黃酮及洗脫液中總黃酮吸光度，做3個(gè)平行試驗(yàn)：

表14 純化工藝的驗(yàn)證

綜合3次平行試驗(yàn)結(jié)果分析，該提取工藝可進(jìn)行重復(fù)性操作，純化的總黃酮達(dá)到50%以上。

3 討論

黃酮的定性鑒別實(shí)驗(yàn)中，觀察到鹽酸-鎂粉反應(yīng)空白管和反應(yīng)管兩管均呈紅色，可以說野薔薇根總黃酮中含有花色素成分。正交試驗(yàn)結(jié)果分析中，可知乙醇溶液的濃度對(duì)野薔薇總黃酮的提取影響較大。在動(dòng)態(tài)吸附過程中，柱子中裝有的棉花對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果存在著一定的影響；不同時(shí)間操作對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也會(huì)造成影響。每兩項(xiàng)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)的結(jié)果會(huì)有較大些的偏差，但每一項(xiàng)內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差較小，結(jié)果趨勢(shì)明顯。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)的高效性和經(jīng)濟(jì)性，該提取工藝和純化工藝值得推廣，可為今后開發(fā)利用野薔薇根提供簡便快捷的方法途徑。

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