李秋澤，趙成光

肺癌在所有惡性腫瘤發(fā)病率中占20%［1］，由于其能通過種種原因逃逸免疫機制監(jiān)視［2］，所以也是歷年來難以緩解、復發(fā)率最高的癌癥。常規(guī)治療肺癌的方法如化療、手術雖有一定成效［3，4］，但是多發(fā)患者隨治療時間增長的獲得耐藥性與腫瘤細胞轉移病灶無法根除等情況，總有效果并不如人意，肺癌患者三年以內復發(fā)率高達80%［5］，五年以內復發(fā)率為10%。調查患者生存曲線發(fā)現(xiàn)，肺癌患者三年生存率為 36%，五年生存率低至15%［6］，中位生存期穩(wěn)定在30個月［7］。為了解決這一狀況，免疫治療方法［8］逐漸進入肺癌治療領域。T細胞為殺滅腫瘤細胞［9］主要參與者，腫瘤細胞表面 PD-L 分子［10］表達程度會影響T細胞的分化生成。所以筆者觀察PD-L1在肺癌細胞株表面表達情況，以及其對T細胞的影響程度，從而為肺癌的免疫治療方法提供有效可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料流式細胞儀（美國BECKMAN COULTER公司），用于流式細胞術對細胞進行自動分選；T細胞分選試劑盒（美國BECKMAN COULTER公司）用于分選人體外周靜脈血T淋巴細胞;24孔與96孔培養(yǎng)板（美國COSTAR公司）依次用于PHA與肺癌細胞株與Treg細胞共同培養(yǎng);倒置顯微鏡（中國OLYMPUS公司）觀測活化細胞、拍照，用于檢測最適PHA濃度；健康人的外周靜脈血SPCA-1、H1299、A549三種肺癌細胞株 （美國 ATCC公司），熒光染色法檢測細胞無污染后，用于肺癌細胞株與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)實驗。

1.2 流式細胞術檢測PD-L1在肺癌細胞上的表達

選取三種肺癌細胞株生長速率最高的時期，37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。收集外壁生長的細胞株，用PBS（磷酸鹽緩沖液）離心洗滌2次后再用緩沖液將細胞重懸，通過流式細胞儀檢測PD-L1的表達水平。

1.3 實驗方法

1.3.1 活化因子PHA最適濃度 通過常規(guī)分離Ficooll法［11］分離人體外周靜脈血單核細胞后再通過免疫磁珠法［12］分選出來的 T 淋巴細胞與 0、5、10、15、20（μg/ml）共 5個濃度梯度的 PHA 置于 24孔培養(yǎng)板共同培養(yǎng)，72 h后倒置顯微鏡觀察，通過細胞生長狀態(tài)與細胞團數(shù)量進行評定，得出最適濃度。

1.3.2 肺癌細胞株與外周血Treg細胞的共同培養(yǎng)

以TGF-β （轉化生長因子-β）與PD-L1抑制素、TGF-β抑制素的存在與否設置實驗，實驗組別設置為 1、2、3。實驗 1 組：肺癌細胞株 X、Treg細胞、活化因子PHA；實驗2組：肺癌細胞株X、Treg細胞、活化因子PHA、TGF-β；實驗3組：肺癌細胞株X、活化因子PHA、PD-L1抑制素與TGF-β抑制素。最后通過流式細胞法檢測各實驗組分化的Treg細胞所占的總體比例。

1.4 統(tǒng)計學方法確定最終統(tǒng)計的數(shù)據(jù)后，運用Graph Prism 5.0統(tǒng)計專用軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用x±s表示，比較運用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺癌細胞株表面PD-L1分子表達水平運用流式細胞術對對SPCA-1、H1299、A549三種肺癌細胞株表面的PD-L1分子表達水平進行檢測并繪制圖像，詳見圖1。

觀察結果發(fā)現(xiàn)，各肺癌細胞株PD-L1分子表達程度有所差異。SPCA-1表達率最高為 （98.5±1.1）%；H1299 次之為 （91.0±3.2）%；A549 最低，為（20.1±6.4）%，三組分別相比都具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。由于SPCA-1肺癌細胞株中PD-L1分子表達水平最高，將此細胞株與Treg細胞進行共同培養(yǎng)。

2.2 肺癌細胞株表面PD-L1分子表達水平對誘導Treg細胞分化生成的影響

圖1 流式細胞術結果圖示（三種細胞株）

2.2.1 不同濃度活化因子PHA對外周血Treg細胞的活化程度 通過倒置顯微鏡觀察得知，活化因子濃度為0 μg/ml時Treg細胞生長狀態(tài)為單個離散型；隨著濃度的升高，Treg細胞逐漸出現(xiàn)明顯增值，細胞團數(shù)量增加等情況?；罨蜃覲HA濃超過10 μg/ml時，細胞大量增殖同時出現(xiàn)大面積覆蓋的細胞凋零聚集而成的黑色細胞團。經實驗可知，活化因子PHA的最適濃度為10 g/ml。

2.2.2 共同培養(yǎng)Treg細胞活化實驗結果 1、2組對比發(fā)現(xiàn)：Treg細胞分化2組 （19.70%）多于1組（12.50%），證明TGP-β能夠提高Treg細胞分化生成比例，且差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2、3組對比發(fā)現(xiàn)：2組 （19.70%）Treg細胞分化生成比例多于3組（6.20%），即PD-L1蛋白分子具有誘導Treg細胞分化生成的能力，與TGF-β同時存在發(fā)揮作用時表現(xiàn)為協(xié)同作用，應用抑制劑能夠顯著影響Treg細胞分化，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 詳見圖 2。

圖2 實驗1、2、3的Treg細胞活化實驗結果

3 討論

近年來，肺癌發(fā)病率在惡性腫瘤中占有比重越來越大，而且常發(fā)生在40歲以上有常年吸煙史的人群中。臨床表現(xiàn)為咯血、胸悶脹痛等癥狀，患者常常因此疲于運動、難以休息，嚴重影響生活質量，危及生命健康?；煛⒎暖?、手術為常用的肺癌治療方法，但由于治療緩解效率低、復發(fā)率高、不良反應大等情況，治療需要其他的可行治療方案配合或代替常規(guī)肺癌治療手段。腫瘤難以根除一大部分由于其能夠進行免疫逃逸［13-15］，腫瘤細胞通過病原體持續(xù)性的中和抗原并突變，保持連續(xù)性感染，中和免疫機制的清除作用；病原體躲避在人體正常肺部細胞內保持休眠，逃逸多重免疫機制的巡回監(jiān)視；病原體通過其本身的組成分子或分子結構影響、阻止免疫機制的生成或者兩者保持拮抗狀態(tài)。由此能夠增強患者自身免疫能力以及低不良反應的新治療手段即免疫治療方法，進入了肺癌治療領域。

該研究原理為：T細胞在APC（抗原呈遞細胞）表面的共刺激分子作用下大量增殖，其中一部分分化為CTL（細胞毒性T淋巴細胞），CTL與先前可識別的腫瘤細胞結合并將之殺傷裂解。T細胞增殖受T表面PD-1分子與APC細胞表面PD-L1控制，兩個共抑制分子結合抑制T細胞活化，控制免疫細胞增殖。而近些年研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1活躍表達于多種類實體腫瘤中：肺癌、卵巢癌、胰腺癌等。所以腫瘤細胞表面PD-L1分子的高度表達與PD-1分子的大量結合會使特異性免疫細胞凋亡，影響T細胞增殖分化，導致病情進一步惡化。T細胞為殺滅腫瘤細胞的重要參與者，腫瘤細胞表面PD-L分子表達水平會影響T細胞的分化生成。所以通過本研究實驗觀察PD-L1在肺癌細胞株表面表達情況，以及其對T細胞的影響程度，從而為肺癌的免疫治療方法提供有效可靠的依據(jù)。

綜上所述，PD-L1是誘導Treg細胞分化生成的重要影響因素之一，免疫治療可能是肺癌治療的有效可行方法。

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