李 蕓，王李忻，葛夢(mèng)嬌，尹軍霞，陳夢(mèng)娜

（紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江紹興312000）

隨著人民生活水平提高、飲食習(xí)慣和能源結(jié)構(gòu)的改變，餐廚垃圾在生活垃圾中所占的比例逐年升高，近年我國(guó)每天產(chǎn)生的餐廚垃圾約占生活垃圾的50%［1］。目前，城市餐廚垃圾的主要處理方法是生產(chǎn)飼料或者有機(jī)肥料，但餐廚垃圾來(lái)源分散，收集和運(yùn)輸都很麻煩，而且餐廚垃圾還容易腐敗發(fā)臭［2－3］，且多數(shù)農(nóng)村沒(méi)有餐廚垃圾全面的收運(yùn)和處理系統(tǒng)，大部分的餐廚垃圾直接喂生豬和畜禽，一部分被直接排入就近水系或土壤，或者隨同其他生活垃圾一起被填埋處理，嚴(yán)重污染了環(huán)境［4］。因此將餐廚垃圾就地產(chǎn)生就地消納的原位消除技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)餐廚垃圾無(wú)害化、減量化和資源化的有效途徑［1，5－6］。能針對(duì)性地降解餐廚垃圾主要成分的微生物菌劑是原位消除技術(shù)的關(guān)鍵。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者圍繞著降解餐廚垃圾中的淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)四大類(lèi)有機(jī)物，篩選到了許多原位降解菌株［1－3，6－7］。然而，常見(jiàn)飲食中的雞爪、雞翅、豬蹄、魚(yú)皮、肉皮等還會(huì)產(chǎn)生含膠原蛋白的餐廚垃圾；水鄉(xiāng)或沿海地區(qū)餐廚垃圾中蝦殼、蟹殼的主要成分是幾丁質(zhì)。針對(duì)餐廚垃圾中膠原蛋白和幾丁質(zhì)降解菌的篩選，目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬篩選能同時(shí)降解膠原蛋白和幾丁質(zhì)的降解菌，為餐廚垃圾原位消除技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

從浙江省紹興市周邊農(nóng)村收集的餐廚垃圾（蟹殼、蝦殼、豬蹄、雞爪、雞皮等殘?jiān)┮约皬男笕馐袌?chǎng)、屠宰場(chǎng)等處采集的土樣、水樣。

1.2 培養(yǎng)基配制

富集培養(yǎng)基：明膠 1 g／mL，幾丁質(zhì) 5 g／mL，NaCl 5 g／mL，蛋白胨5 g／mL，pH值7.2～7.4。

初篩培養(yǎng)基 1：明膠 20 g／mL，NaCl 0.1 g／mL，蛋白胨5 g／mL，KH2PO40.5 g／mL，MgSO40.2 g／mL，瓊脂 20 g／mL，pH值7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g／mL，NaCl 5 g／mL，蛋白胨10 g／mL，pH值 7.2～7.4。

初篩培養(yǎng)基 2：（NH4）2·SO45 g／mL，KH2PO41 g／mL，MgSO40.25 g／mL，酵母粉 2 g／mL，幾丁質(zhì) 10 g／mL，瓊脂20 g／mL，pH值 7.0～7.4。

產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)液：幾丁質(zhì) 5.0 g／mL，蛋白胨 5.0 g／mL，酵母粉 2.5 g／mL，NaCl5.0 g／mL，pH值 7.0。

復(fù)篩培養(yǎng)基：幾丁質(zhì) 5 g／mL，蛋白胨 3 g／mL，KH2PO40.3 g／mL，K2HPO40.7 g／mL，MgSO40.5 g／mL，NaCl 5.0 g／mL，pH值 7.0～7.4。

1.3 富集培養(yǎng)

取2 g土樣、2mL水樣或2mL餐廚垃圾水洗樣接種到富集培養(yǎng)基中，37℃、150 r／min搖瓶培養(yǎng)2 d。

1.4 膠原蛋白降解菌的平板初篩和豬皮消化試驗(yàn)

將富集培養(yǎng)液梯度稀釋液涂布初篩平板1（初篩培養(yǎng)基1制作的平板）中，37℃培養(yǎng)24 h，按吳琦等的方法［8］平板初篩膠原蛋白降解菌。分別挑取初篩菌株1環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 d，4 000 r／min離心10 min，取上清液，按吳琦等的方法［8］檢測(cè)上清液消化新鮮豬皮的效果。

1.5 幾丁質(zhì)降解菌的平板初篩和蝦殼消化試驗(yàn)

取消化豬皮效果明顯的菌株點(diǎn)種于初篩平板2（初篩培養(yǎng)基2制作的平板）中，37℃培養(yǎng)48 h，取水解圈直徑與菌落直徑比值較大者進(jìn)行復(fù)篩［9］。挑取幾丁質(zhì)降解菌接種于產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)2 d后，4 000 r／min離心10 min。將大小質(zhì)量基本相同的蝦殼洗凈晾干，分別裝入試管后滅菌，每管加入上清液各10 mL，蓋上棉塞，室溫放置4 d。另取1管加入10 mL無(wú)菌培養(yǎng)液作為對(duì)照。

1.6 酶活測(cè)定

取消化蝦殼效果明顯的菌株1環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、150 r／min培養(yǎng)24 h，再按5%的接種量接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，37℃、150 r／min培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液5 000 r／min離心10 min后，取上清液測(cè)定膠原蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性。

膠原蛋白酶活力測(cè)定采用茚三酮顯色法［8］，以Ⅲ型膠原蛋白（購(gòu)自SIGMA公司）作為底物，測(cè)定反應(yīng)所釋放的水溶性氨基酸、短肽，以甘氨酸顯色制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。在37℃、pH值7.5條件下，1 mL酶液1 min水解膠原蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol甘氨酸的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定采用DNS法［9］，1個(gè)酶活力單位定義：1 h釋放出相當(dāng)于100μg N－乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。

1.7 菌種鑒定

菌種形態(tài)和生理生化鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［10］；16S rDNA測(cè)序參照喬長(zhǎng)晟等的方法［2］。

1.8 餐廚垃圾的原位降解

從紹興周邊收集餐廚垃圾，挑出垃圾中雞皮、雞爪、雞翅、蝦殼、蟹殼等殘?jiān)b入桶里，每桶裝樣量為0.5 kg，再按10%的接種量接入選定菌的種子培養(yǎng)液，室外（溫度15～25℃）放置48 h，處理前和處理后測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量（重鉻酸鉀法），計(jì)算降解率。每組3個(gè)平行，以接種10%的無(wú)菌種子培養(yǎng)液作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白降解菌的平板初篩及豬皮消化試驗(yàn)

篩選到18株消化豬皮效果明顯的膠原蛋白降解菌，其中A1、A2、A5、A6、A7、B1、B2、B3、B4、B7、C3等 11株菌消化后的豬皮體積不足對(duì)照的1／3（圖1），為高效降解膠原蛋白的菌株。

2.2 幾丁質(zhì)降解菌的平板初篩及蝦殼消化試驗(yàn)

11株高效降解膠原蛋白的菌株中，B3和C3在含幾丁質(zhì)的平板上產(chǎn)生了明顯的透明圈（圖2），說(shuō)明B3和C3能夠降解幾丁質(zhì)。B3和C3都能消化蝦殼，其中B3將蝦殼完全消化成了沙粒大小的碎渣，消化液也因此變得渾濁（圖3），表明B3降解蝦殼的幾丁質(zhì)酶活性很高。

2.3 復(fù)篩

B3的膠原蛋白酶活性和C3差異不顯著，而幾丁質(zhì)酶活性顯著比C3高（表1）。選取B3作為目標(biāo)菌進(jìn)行鑒定。

表1 2株菌酶活性測(cè)定結(jié)果

2.4 菌種的鑒定

2.4.1 形態(tài)鑒定 B3在酪氨酸培養(yǎng)基上菌落呈白色，不透明，圓形，邊緣不整齊。革蘭氏染色陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.4.2 生理生化鑒定 B3的常見(jiàn)生理生化特征見(jiàn)表2。

2.4.3 16S rDNA測(cè)序 B3的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段經(jīng)寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序，確定片段長(zhǎng)度為1 463 bp（GenBank登陸號(hào)：KP716831），經(jīng)過(guò) GenBank核酸數(shù)據(jù)BLAST分析和 ClustalX 1.8.1比對(duì)，使用 MEGA4按Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）。B3與Bacillus subtilis和Bacillus atrophaeus的序列相似性都達(dá)99%以上，結(jié)合形態(tài)（特別是在酪氨酸培養(yǎng)基上菌落無(wú)明顯黑色素產(chǎn)生）和生理生化特征，B3被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表2 B3生理生化特征

2.5 餐廚垃圾的原位降解

B3原位降解富含膠原蛋白和幾丁質(zhì)的餐廚垃圾2 d后，垃圾中的有機(jī)質(zhì)含量與對(duì)照相比，顯著降低，降解效果達(dá)到24.78%，比對(duì)照高 174%（表3）。

表3 B3原位降解餐廚垃圾的效果

3 討論

餐廚垃圾的微生物原位降解技術(shù)，利用微生物在餐廚垃圾的源頭進(jìn)行減量和消納，不僅可以降低生活垃圾社區(qū)和市政收集、運(yùn)輸和處理的難度，還可以制造有機(jī)肥料就地用于陽(yáng)臺(tái)花園的種植，是餐廚垃圾綠色環(huán)保處理方式［11－12］。水鄉(xiāng)或沿海地區(qū)的餐廚垃圾富含膠原蛋白和幾丁質(zhì)，原位降解這類(lèi)餐廚垃圾時(shí)，高效降解膠原蛋白和幾丁質(zhì)的微生物是關(guān)鍵。國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者從富含膠原蛋白的環(huán)境中篩選到了能降解膠原蛋白的微生物［13－14］，也有很多學(xué)者從幾丁質(zhì)的環(huán)境中篩選到了降解幾丁質(zhì)的菌種［9，15－16］。本研究首次從餐廚垃圾中分離到了1株既能降解膠原蛋白又能降解幾丁質(zhì)的菌株，該菌室外原位降解富含膠原蛋白和幾丁質(zhì)的餐廚垃圾2 d的降解效果達(dá)到24.78%。而且，該菌淀粉水解陽(yáng)性，如應(yīng)用在餐廚垃圾的原位降解上，將能發(fā)揮同時(shí)降解膠原蛋白、幾丁質(zhì)、淀粉的三重功效，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

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