李小紅，吳地堯，李 安，張靜宜，吳德智

（1.貴州理工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550003；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330004）

纈草（Valeriana officinalis L.）為敗醬科纈草屬多年生草本植物，具有鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥等神經(jīng)系統(tǒng)作用，同時(shí)具有調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)和抗氧化、抗腫瘤等藥理活性［1］。纈草含有揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、生物堿類(lèi)等活性成分，其中揮發(fā)油是纈草的主要活性成分。目前，纈草揮發(fā)油的提取方法主要是水蒸氣蒸餾法，但該方法存在能耗高、提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低、揮發(fā)油外觀(guān)與氣味發(fā)生明顯變化等不足。近年來(lái)興起的超臨界流體萃取已經(jīng)應(yīng)用于纈草揮發(fā)油的提取［2］，該方法高效、得油率高、安全環(huán)保，但成本較高。目前微波輔助提取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于揮發(fā)油提取［3－6］，該法能在較短時(shí)間完成提取，減少了揮發(fā)油因長(zhǎng)時(shí)間高溫所造成的含氧化合物熱解、水解、氧化等，具有能量利用率高、提取速率快、得率高、可維持揮發(fā)油的天然品質(zhì)等特點(diǎn)［7］。本研究以纈草揮發(fā)油提取率為主要指標(biāo)，通過(guò)單因素及Box－Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助水蒸氣蒸餾提取工藝條件，并通過(guò)還原力、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（簡(jiǎn)稱(chēng)DPPH）自由基清除力以及羥自由基清除力的測(cè)定，與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法所得揮發(fā)油的抗氧化能力進(jìn)行比較，以期為纈草的藥用和食用產(chǎn)品研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

纈草根莖，采自貴州省江口縣纈草種植基地。正己烷、無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用其他試劑均為分析純。

Scientz－IIDM微波光波超聲波萃取儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；FA1004B電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海上天精密儀器有限公司；UV－2550型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)，梅特勒－托利多國(guó)際股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纈草揮發(fā)油的提取工藝 采用一般水蒸氣蒸餾法對(duì)纈草揮發(fā)油進(jìn)行提取。稱(chēng)取適量樣品，加一定量NaCl溶液，振搖混合后浸泡一定時(shí)間。連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管，保持微沸，蒸餾一段時(shí)間后停止加熱，靜置，取揮發(fā)油，加無(wú)水硫酸鈉過(guò)夜，過(guò)濾得纈草揮發(fā)油提取物備用，與微波輔助提取的纈草揮發(fā)油進(jìn)行抗氧化活性的比較。

參照譚承佳等的微波輔助提取揮發(fā)油的方法［8］對(duì)纈草揮發(fā)油進(jìn)行提取。取適量纈草，將正己烷按一定比例加入圓底燒瓶?jī)?nèi)，置于改良的微波爐腔內(nèi)。根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)定微波功率與時(shí)間，回流提取后冷卻至室溫，抽濾，收集濾液，適量濃縮，水浴蒸干得到微波提取物。再采用上述一般水蒸氣蒸餾法收集纈草揮發(fā)油，計(jì)算揮發(fā)油得率：

1.2.2 單因素考察微波輔助提取工藝 本試驗(yàn)針對(duì)微波功率（150、300、450、600、750 W）、提取時(shí)間（10、15、20、25、30、35 min）、液料比（4 mL∶1 g、6 mL∶1 g、8 mL∶1 g、10 mL∶1 g、12 mL∶1 g）3個(gè)因素，保持其中2個(gè)變量固定不變，對(duì)另1個(gè)變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以揮發(fā)油提取率為指標(biāo)，以確定Box－Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)所需的水平范圍。

1.2.3 Box－Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)選纈草揮發(fā)油提取工藝在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取微波功率、提取時(shí)間、液料比3個(gè)對(duì)揮發(fā)油提取率影響較大的因素，用 Design－Expert 8.0.6提供的Box－Behnken試驗(yàn)，以揮發(fā)油提取率為指標(biāo)優(yōu)化提取工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1、表2所示。

表1 Box－Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表2 纈草揮發(fā)油提取的Box－Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.2.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參照 Kim等的方法［9］進(jìn)行DPPH自由基清除能力的測(cè)定。以無(wú)水乙醇為溶劑，將揮發(fā)油配制成濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg／mL的溶液備用。精確吸取上述不同濃度的溶液300μL，與2 mL 0004%DPPH溶液充分混合后于室溫靜置20min，在517 nm處測(cè)其吸光度D517nm（1）。以不加提取液的DPPH為空白對(duì)照，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定溶液在517 nm處的吸光度D517nm（0）。精確吸取300μL上述不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)油溶液，分別與2 mL無(wú)水乙醇混合均勻后，以無(wú)水乙醇為對(duì)照，測(cè)定各溶液在517 nm處的吸光度D517nm（2）。用同樣的方法對(duì)水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式如下：

1.2.5 鐵氰化鉀還原法測(cè)定還原力 參照劉水英等的方法［10］對(duì)還原力進(jìn)行測(cè)定。配制不同濃度的揮發(fā)油樣品溶液。取1.5 mL樣品，加入1.5 mL pH值6.6的磷酸鹽緩沖液和1.5 mL六氰合鐵酸鉀溶液，混勻后于50℃恒溫放置20 min，快速冷卻后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，于3 000 r／min離心10 min，取1 mL上清液再加入1 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻并靜置后，于700 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度表示還原能力，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。用同樣的方法對(duì)水蒸氣蒸餾法提取的纈草揮發(fā)油的還原力進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 羥自由基清除率 參照陳美珍等的方法［11－12］進(jìn)行羥自由基清除力的測(cè)定。配制不同濃度的揮發(fā)油樣品溶液，取1.5 mL樣品，分別加入 1.0 mL 2.5 mmol／L水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol／L FeSO4溶液和 2.0 mL蒸餾水，充分混勻，加入1.0 mL 5 mmol／L H2O2，先置于 37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，再于510 nm處測(cè)定其吸光度，以蒸餾水作為空白參比，以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。用同樣的方法對(duì)水蒸氣蒸餾法提取的纈草揮發(fā)油的羥自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，具體公式如下：

式中：D510nm（0）為空白對(duì)照吸光度；D510nm（2）為加 H2O2樣品溶液吸光度；D510nm（1）為不加H2O2樣品溶液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察揮發(fā)油微波輔助提取工藝

2.1.1 微波功率對(duì)揮發(fā)油提取率的影響 由圖1可知，隨著微波功率的增加，揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)微波功率為300W時(shí)，揮發(fā)油提取率為（5.27±0.27）%。分析其原因，主要由于當(dāng)功率升高時(shí)，溫度過(guò)高，低沸點(diǎn)物質(zhì)隨介質(zhì)沸騰而有所損失。因此，選定150～450 W為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的最佳水平。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響 由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增加，揮發(fā)油提取率呈先上升后穩(wěn)定在一定水平再下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為20～30 min時(shí)，提取率穩(wěn)定在（4.75±0.16）%左右，當(dāng)繼續(xù)增加提取時(shí)間，揮發(fā)油被破壞或從介質(zhì)揮發(fā)從而出現(xiàn)提取率下降的趨勢(shì)。因此，選定15～30 min為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的提取時(shí)間范圍。

2.1.3 液料比對(duì)揮發(fā)油提取率的影響 由圖3可知，隨著液料比的增加，揮發(fā)油提取率先上升后穩(wěn)定在一定水平，沒(méi)有明顯提高。當(dāng)液料比為8 mL∶1 g時(shí)，提取率穩(wěn)定在（5.7±0.25）%左右。主要是因?yàn)樘崛∫旱脑黾涌墒估i草與提取溶劑充分接觸，有利于揮發(fā)油的浸出。當(dāng)液料比超過(guò)8mL∶1 g時(shí)，揮發(fā)油的提取基本達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，選定（6～10 mL）∶1 g為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的水平。

2.2 Box－Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化揮發(fā)油微波輔助提取工藝

采用 Design－Expert8.0.6提供的 Box－Behnken試驗(yàn)對(duì)各因素進(jìn)行擬合，得到多元回歸方程：

R提取率＝－6.100 5＋0.043 7A＋0.091 4B＋0.832 3C－3.555 5×10－5AB＋2.333 3×10－4AC＋0.020 8BC－6.790 0×10－5A2－4.893 3×10－3B2－0.085 1C2。

對(duì)揮發(fā)油提取率的回歸模型進(jìn)行方差及顯著性分析的結(jié)果見(jiàn)表3?？梢钥闯?，該模型方程有極顯著影響（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.061 2＞0.05），說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下，該回歸模型所考察的因素足以反映試驗(yàn)中各提取工藝參數(shù)對(duì)揮發(fā)油提取率的影響。R2＝0.988 0＝0.972 5，說(shuō)明回歸模型與試驗(yàn)值擬合均較好，可用于揮發(fā)油提取率的理論推測(cè)和分析，各因素影響大小依次為微波功率＞提取時(shí)間＞液料比。由F檢驗(yàn)結(jié)果可知，一次項(xiàng)中微波功率、提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油的提取率具有極顯著影響（P＜001），交互項(xiàng)中提取時(shí)間與液料比之間的交互作用對(duì)揮發(fā)油提取率具有極顯著影響（P＜0.01）；在二次項(xiàng)中微波功率、提取時(shí)間、液料比均對(duì)揮發(fā)油提取率具有極顯著影響（P＜001），其他因素之間影響不顯著。表3的結(jié)果與圖4中響應(yīng)面圖反映的各因素間的交互作用吻合。

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由Design－Expert8.0.6軟件得出，揮發(fā)油提取的最佳工藝參數(shù)是微波功率326.30 W、提取時(shí)間25.48 min、液料比8.57 mL∶1 g，在此條件下?lián)]發(fā)油的提取率為5.89%。為便于生產(chǎn)試驗(yàn)需求，設(shè)定微波功率為330 W，提取時(shí)間為25 min，液料比為8.6 mL∶1 g，進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出揮發(fā)油提取率為（5.92±0.07）%。該值與預(yù)測(cè)值比較近，因此選取微波功率330W、提取時(shí)間25 min、液料比8.6 mL∶1 g作為微波輔助提取纈草揮發(fā)油的工藝參數(shù)。

2.3 不同提取工藝提取的纈草揮發(fā)油抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果 由圖5可知，水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除能力，且纈草揮發(fā)油濃度與DPPH清除率存在正相關(guān)關(guān)系，微波輔助提取的清除能力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當(dāng)纈草揮發(fā)油濃度為0.5 mg／mL時(shí)，微波輔助提取法的清除率為80.9%，而水蒸氣蒸餾法的清除率為70.2%。

2.3.2 還原力測(cè)定結(jié)果 吸光度與樣品的還原力具有正相關(guān)關(guān)系，吸光度越大，樣品的還原力越強(qiáng)。由圖6可知，水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發(fā)油均具有較強(qiáng)的還原能力，說(shuō)明該纈草揮發(fā)油也具有較強(qiáng)的抗氧化能力。在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，纈草揮發(fā)油的還原力隨著濃度的升高而增強(qiáng)，且微波輔助提取的纈草揮發(fā)油還原力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當(dāng)纈草揮發(fā)油濃度為0.5 mg／mL時(shí)，微波輔助提取法的吸光度為1.35。

2.3.3 羥自由基清除率 由圖7可知，水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發(fā)油對(duì)羥自由基均有較強(qiáng)的清除能力，隨著揮發(fā)油濃度的增加，清除率也隨之提高，微波輔助提取的清除能力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當(dāng)纈草揮發(fā)油濃度為0.5 mg／mL時(shí)，微波輔助提取法的清除率為78.9%，而水蒸氣蒸餾法的清除率為73.1%。

3 結(jié)論

響應(yīng)面法已廣泛應(yīng)用于化工、食品、農(nóng)林、冶金等各領(lǐng)域，具有試驗(yàn)次數(shù)少、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。本研究以纈草為主要原料，采用Box－Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，對(duì)其揮發(fā)油微波輔助提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)微波輔助提取的揮發(fā)油與一般水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油進(jìn)行抗氧化性能研究。結(jié)果表明，微波輔助提取揮發(fā)油的最佳工藝條件為微波功率330 W、提取時(shí)間25 min、液料比8.6 mL∶1 g，此條件下提取的纈草揮發(fā)油得率為（5.92±0.07）%。本試驗(yàn)揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定可行，提取率高，具有較強(qiáng)的還原能力，對(duì)DPPH自由基、羥自由基均有較強(qiáng)的清除能力，抗氧化能力與一般水蒸氣蒸餾法相比具有顯著差異。微波輔助提取是一種節(jié)能、高效、提取植物高品質(zhì)揮發(fā)油的新技術(shù)，在植物開(kāi)發(fā)及食品研究中具有很好的應(yīng)用前景。

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