李小紅，吳地堯，李 安，張靜宜，吳德智

（1.貴州理工學(xué)院，貴州貴陽550003；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330004）

纈草（Valeriana officinalis L.）為敗醬科纈草屬多年生草本植物，具有鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥等神經(jīng)系統(tǒng)作用，同時具有調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)和抗氧化、抗腫瘤等藥理活性［1］。纈草含有揮發(fā)油、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類等活性成分，其中揮發(fā)油是纈草的主要活性成分。目前，纈草揮發(fā)油的提取方法主要是水蒸氣蒸餾法，但該方法存在能耗高、提取時間長、提取效率低、揮發(fā)油外觀與氣味發(fā)生明顯變化等不足。近年來興起的超臨界流體萃取已經(jīng)應(yīng)用于纈草揮發(fā)油的提?。?］，該方法高效、得油率高、安全環(huán)保，但成本較高。目前微波輔助提取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于揮發(fā)油提?。?－6］，該法能在較短時間完成提取，減少了揮發(fā)油因長時間高溫所造成的含氧化合物熱解、水解、氧化等，具有能量利用率高、提取速率快、得率高、可維持揮發(fā)油的天然品質(zhì)等特點［7］。本研究以纈草揮發(fā)油提取率為主要指標(biāo)，通過單因素及Box－Behnken響應(yīng)曲面試驗優(yōu)化微波輔助水蒸氣蒸餾提取工藝條件，并通過還原力、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（簡稱DPPH）自由基清除力以及羥自由基清除力的測定，與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法所得揮發(fā)油的抗氧化能力進(jìn)行比較，以期為纈草的藥用和食用產(chǎn)品研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

纈草根莖，采自貴州省江口縣纈草種植基地。正己烷、無水乙醇、鐵氰化鉀，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用其他試劑均為分析純。

Scientz－IIDM微波光波超聲波萃取儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；FA1004B電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海上天精密儀器有限公司；UV－2550型紫外－可見分光光度計，梅特勒－托利多國際股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 纈草揮發(fā)油的提取工藝 采用一般水蒸氣蒸餾法對纈草揮發(fā)油進(jìn)行提取。稱取適量樣品，加一定量NaCl溶液，振搖混合后浸泡一定時間。連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，保持微沸，蒸餾一段時間后停止加熱，靜置，取揮發(fā)油，加無水硫酸鈉過夜，過濾得纈草揮發(fā)油提取物備用，與微波輔助提取的纈草揮發(fā)油進(jìn)行抗氧化活性的比較。

參照譚承佳等的微波輔助提取揮發(fā)油的方法［8］對纈草揮發(fā)油進(jìn)行提取。取適量纈草，將正己烷按一定比例加入圓底燒瓶內(nèi)，置于改良的微波爐腔內(nèi)。根據(jù)試驗要求設(shè)定微波功率與時間，回流提取后冷卻至室溫，抽濾，收集濾液，適量濃縮，水浴蒸干得到微波提取物。再采用上述一般水蒸氣蒸餾法收集纈草揮發(fā)油，計算揮發(fā)油得率：

1.2.2 單因素考察微波輔助提取工藝 本試驗針對微波功率（150、300、450、600、750 W）、提取時間（10、15、20、25、30、35 min）、液料比（4 mL∶1 g、6 mL∶1 g、8 mL∶1 g、10 mL∶1 g、12 mL∶1 g）3個因素，保持其中2個變量固定不變，對另1個變量進(jìn)行單因素試驗，以揮發(fā)油提取率為指標(biāo)，以確定Box－Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計所需的水平范圍。

1.2.3 Box－Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)選纈草揮發(fā)油提取工藝在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取微波功率、提取時間、液料比3個對揮發(fā)油提取率影響較大的因素，用 Design－Expert 8.0.6提供的Box－Behnken試驗，以揮發(fā)油提取率為指標(biāo)優(yōu)化提取工藝參數(shù)，試驗設(shè)計如表1、表2所示。

表1 Box－Behnken響應(yīng)面試驗因素與水平

表2 纈草揮發(fā)油提取的Box－Behnken響應(yīng)曲面試驗設(shè)計及評價指標(biāo)

1.2.4 DPPH自由基清除能力測定 參照 Kim等的方法［9］進(jìn)行DPPH自由基清除能力的測定。以無水乙醇為溶劑，將揮發(fā)油配制成濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg／mL的溶液備用。精確吸取上述不同濃度的溶液300μL，與2 mL 0004%DPPH溶液充分混合后于室溫靜置20min，在517 nm處測其吸光度D517nm（1）。以不加提取液的DPPH為空白對照，以維生素C為陽性對照，測定溶液在517 nm處的吸光度D517nm（0）。精確吸取300μL上述不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)油溶液，分別與2 mL無水乙醇混合均勻后，以無水乙醇為對照，測定各溶液在517 nm處的吸光度D517nm（2）。用同樣的方法對水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油DPPH自由基清除能力進(jìn)行測定，計算公式如下：

1.2.5 鐵氰化鉀還原法測定還原力 參照劉水英等的方法［10］對還原力進(jìn)行測定。配制不同濃度的揮發(fā)油樣品溶液。取1.5 mL樣品，加入1.5 mL pH值6.6的磷酸鹽緩沖液和1.5 mL六氰合鐵酸鉀溶液，混勻后于50℃恒溫放置20 min，快速冷卻后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，于3 000 r／min離心10 min，取1 mL上清液再加入1 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻并靜置后，于700 nm處測定吸光度，以吸光度表示還原能力，以維生素C為陽性對照。用同樣的方法對水蒸氣蒸餾法提取的纈草揮發(fā)油的還原力進(jìn)行測定。

1.2.6 羥自由基清除率 參照陳美珍等的方法［11－12］進(jìn)行羥自由基清除力的測定。配制不同濃度的揮發(fā)油樣品溶液，取1.5 mL樣品，分別加入 1.0 mL 2.5 mmol／L水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol／L FeSO4溶液和 2.0 mL蒸餾水，充分混勻，加入1.0 mL 5 mmol／L H2O2，先置于 37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，再于510 nm處測定其吸光度，以蒸餾水作為空白參比，以維生素C作為陽性對照。用同樣的方法對水蒸氣蒸餾法提取的纈草揮發(fā)油的羥自由基清除率進(jìn)行測定，具體公式如下：

式中：D510nm（0）為空白對照吸光度；D510nm（2）為加 H2O2樣品溶液吸光度；D510nm（1）為不加H2O2樣品溶液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察揮發(fā)油微波輔助提取工藝

2.1.1 微波功率對揮發(fā)油提取率的影響 由圖1可知，隨著微波功率的增加，揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)微波功率為300W時，揮發(fā)油提取率為（5.27±0.27）%。分析其原因，主要由于當(dāng)功率升高時，溫度過高，低沸點物質(zhì)隨介質(zhì)沸騰而有所損失。因此，選定150～450 W為響應(yīng)面設(shè)計的最佳水平。

2.1.2 提取時間對揮發(fā)油提取率的影響 由圖2可知，隨著提取時間的增加，揮發(fā)油提取率呈先上升后穩(wěn)定在一定水平再下降的趨勢。當(dāng)提取時間為20～30 min時，提取率穩(wěn)定在（4.75±0.16）%左右，當(dāng)繼續(xù)增加提取時間，揮發(fā)油被破壞或從介質(zhì)揮發(fā)從而出現(xiàn)提取率下降的趨勢。因此，選定15～30 min為響應(yīng)面設(shè)計的提取時間范圍。

2.1.3 液料比對揮發(fā)油提取率的影響 由圖3可知，隨著液料比的增加，揮發(fā)油提取率先上升后穩(wěn)定在一定水平，沒有明顯提高。當(dāng)液料比為8 mL∶1 g時，提取率穩(wěn)定在（5.7±0.25）%左右。主要是因為提取液的增加可使纈草與提取溶劑充分接觸，有利于揮發(fā)油的浸出。當(dāng)液料比超過8mL∶1 g時，揮發(fā)油的提取基本達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，選定（6～10 mL）∶1 g為響應(yīng)面設(shè)計的水平。

2.2 Box－Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計優(yōu)化揮發(fā)油微波輔助提取工藝

采用 Design－Expert8.0.6提供的 Box－Behnken試驗對各因素進(jìn)行擬合，得到多元回歸方程：

R提取率＝－6.100 5＋0.043 7A＋0.091 4B＋0.832 3C－3.555 5×10－5AB＋2.333 3×10－4AC＋0.020 8BC－6.790 0×10－5A2－4.893 3×10－3B2－0.085 1C2。

對揮發(fā)油提取率的回歸模型進(jìn)行方差及顯著性分析的結(jié)果見表3?？梢钥闯觯撃Ｐ头匠逃袠O顯著影響（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＝0.061 2＞0.05），說明在本試驗條件下，該回歸模型所考察的因素足以反映試驗中各提取工藝參數(shù)對揮發(fā)油提取率的影響。R2＝0.988 0＝0.972 5，說明回歸模型與試驗值擬合均較好，可用于揮發(fā)油提取率的理論推測和分析，各因素影響大小依次為微波功率＞提取時間＞液料比。由F檢驗結(jié)果可知，一次項中微波功率、提取時間對揮發(fā)油的提取率具有極顯著影響（P＜001），交互項中提取時間與液料比之間的交互作用對揮發(fā)油提取率具有極顯著影響（P＜0.01）；在二次項中微波功率、提取時間、液料比均對揮發(fā)油提取率具有極顯著影響（P＜001），其他因素之間影響不顯著。表3的結(jié)果與圖4中響應(yīng)面圖反映的各因素間的交互作用吻合。

表3 試驗結(jié)果方差分析

由Design－Expert8.0.6軟件得出，揮發(fā)油提取的最佳工藝參數(shù)是微波功率326.30 W、提取時間25.48 min、液料比8.57 mL∶1 g，在此條件下?lián)]發(fā)油的提取率為5.89%。為便于生產(chǎn)試驗需求，設(shè)定微波功率為330 W，提取時間為25 min，液料比為8.6 mL∶1 g，進(jìn)一步進(jìn)行驗證試驗，得出揮發(fā)油提取率為（5.92±0.07）%。該值與預(yù)測值比較近，因此選取微波功率330W、提取時間25 min、液料比8.6 mL∶1 g作為微波輔助提取纈草揮發(fā)油的工藝參數(shù)。

2.3 不同提取工藝提取的纈草揮發(fā)油抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定結(jié)果 由圖5可知，水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發(fā)油對DPPH自由基均有較強的清除能力，且纈草揮發(fā)油濃度與DPPH清除率存在正相關(guān)關(guān)系，微波輔助提取的清除能力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當(dāng)纈草揮發(fā)油濃度為0.5 mg／mL時，微波輔助提取法的清除率為80.9%，而水蒸氣蒸餾法的清除率為70.2%。

2.3.2 還原力測定結(jié)果 吸光度與樣品的還原力具有正相關(guān)關(guān)系，吸光度越大，樣品的還原力越強。由圖6可知，水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發(fā)油均具有較強的還原能力，說明該纈草揮發(fā)油也具有較強的抗氧化能力。在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，纈草揮發(fā)油的還原力隨著濃度的升高而增強，且微波輔助提取的纈草揮發(fā)油還原力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當(dāng)纈草揮發(fā)油濃度為0.5 mg／mL時，微波輔助提取法的吸光度為1.35。

2.3.3 羥自由基清除率 由圖7可知，水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發(fā)油對羥自由基均有較強的清除能力，隨著揮發(fā)油濃度的增加，清除率也隨之提高，微波輔助提取的清除能力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當(dāng)纈草揮發(fā)油濃度為0.5 mg／mL時，微波輔助提取法的清除率為78.9%，而水蒸氣蒸餾法的清除率為73.1%。

3 結(jié)論

響應(yīng)面法已廣泛應(yīng)用于化工、食品、農(nóng)林、冶金等各領(lǐng)域，具有試驗次數(shù)少、設(shè)計簡便等優(yōu)點。本研究以纈草為主要原料，采用Box－Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計，對其揮發(fā)油微波輔助提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對微波輔助提取的揮發(fā)油與一般水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油進(jìn)行抗氧化性能研究。結(jié)果表明，微波輔助提取揮發(fā)油的最佳工藝條件為微波功率330 W、提取時間25 min、液料比8.6 mL∶1 g，此條件下提取的纈草揮發(fā)油得率為（5.92±0.07）%。本試驗揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定可行，提取率高，具有較強的還原能力，對DPPH自由基、羥自由基均有較強的清除能力，抗氧化能力與一般水蒸氣蒸餾法相比具有顯著差異。微波輔助提取是一種節(jié)能、高效、提取植物高品質(zhì)揮發(fā)油的新技術(shù)，在植物開發(fā)及食品研究中具有很好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

［1］張 丹，周立新，林能明.纈草的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國臨床藥學(xué)雜志，2014，23（6）：397－402.

［2］李 崗，范文壘，余德順，等.纈草揮發(fā)油的提取及抗氧化能力研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2015，26（11）：2647－2650.

［3］Golmakani T M，Rezaei K.Comparison of microwave－assisted hydrodistillation with the traditional hydrodistillation method in the extraction of essential oils from Thymus vulgaris L.［J］.Food Chem，2008，109（4）：925－930.

［4］Chemat F，Lucchesi M E，Smadja J，et al.Microwave accelerated steam diatillation of essential oil from lavender：a rapid，clean and environmentally friendly approach［J］.Anal Chim Acta，2006，555（1）：157－160.

［5］Wang ZM，Ding L，Li T C，et al.Improved solvent－freemicrowave extraction of essential oil from dried Cuminum cyminum L.and Zanthoxylum bungeanum Maxim［J］.J Chromatogr A，2006，1102（1／2）：11－17.

［6］Viana M A，F(xiàn)ernandez X，Visinoni F，et al.Microwave hydrodiffusion and gravity，a new technique or extraction of essential oils［J］.J Chromatogr A，2008，1190（1）：14－17.

［7］鄒小兵，陶進(jìn)轉(zhuǎn)，夏之寧，等.微波輔助提取揮發(fā)油的研究進(jìn)展［J］.中成藥，2010，32（6）：1014－1020.

［8］譚承佳，溫榮偉，馬家驊，等.微波提取柴胡揮發(fā)油的工藝研究［J］.中成藥，2014，36（6）：1315－1317.

［9］Kim D，Lee K W，Lee H J，et al.Vitamin C equivalent antioxidant capacity（VCEAC）of phenolic phytochemicals［J］.J Agric Food Chem，2002，50（13）：3713－3717.

［10］劉水英，李新生，黨 婭，等.響應(yīng)面法優(yōu)化紫山藥花青苷提取工藝及其抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2014，35（22）：84－91.

［11］陳美珍，余 杰，郭慧敏，等.大豆分離蛋白酶解物清除羥自由基作用的研究［J］.食品科學(xué)，2002，23（1）：43－47.

［12］殷 軍，葛 青，毛建衛(wèi)，等.竹葉多糖的組分及抗氧化活性分析［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（2）：100－103.