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        纈草揮發(fā)油的微波輔助提取工藝及其抗氧化活性

        2018-05-18 01:25:56李小紅吳地堯張靜宜吳德智
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年8期
        關(guān)鍵詞:液料水蒸氣揮發(fā)油

        李小紅,吳地堯,李 安,張靜宜,吳德智

        (1.貴州理工學(xué)院,貴州貴陽(yáng)550003;2.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西南昌330004)

        纈草(Valeriana officinalis L.)為敗醬科纈草屬多年生草本植物,具有鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥等神經(jīng)系統(tǒng)作用,同時(shí)具有調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)和抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[1]。纈草含有揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、生物堿類(lèi)等活性成分,其中揮發(fā)油是纈草的主要活性成分。目前,纈草揮發(fā)油的提取方法主要是水蒸氣蒸餾法,但該方法存在能耗高、提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低、揮發(fā)油外觀(guān)與氣味發(fā)生明顯變化等不足。近年來(lái)興起的超臨界流體萃取已經(jīng)應(yīng)用于纈草揮發(fā)油的提取[2],該方法高效、得油率高、安全環(huán)保,但成本較高。目前微波輔助提取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于揮發(fā)油提取[3-6],該法能在較短時(shí)間完成提取,減少了揮發(fā)油因長(zhǎng)時(shí)間高溫所造成的含氧化合物熱解、水解、氧化等,具有能量利用率高、提取速率快、得率高、可維持揮發(fā)油的天然品質(zhì)等特點(diǎn)[7]。本研究以纈草揮發(fā)油提取率為主要指標(biāo),通過(guò)單因素及Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助水蒸氣蒸餾提取工藝條件,并通過(guò)還原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(簡(jiǎn)稱(chēng)DPPH)自由基清除力以及羥自由基清除力的測(cè)定,與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法所得揮發(fā)油的抗氧化能力進(jìn)行比較,以期為纈草的藥用和食用產(chǎn)品研究提供基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        纈草根莖,采自貴州省江口縣纈草種植基地。正己烷、無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;所用其他試劑均為分析純。

        Scientz-IIDM微波光波超聲波萃取儀,寧波新芝生物科技股份有限公司;FA1004B電子天平,上海越平科學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海上天精密儀器有限公司;UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 纈草揮發(fā)油的提取工藝 采用一般水蒸氣蒸餾法對(duì)纈草揮發(fā)油進(jìn)行提取。稱(chēng)取適量樣品,加一定量NaCl溶液,振搖混合后浸泡一定時(shí)間。連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管,保持微沸,蒸餾一段時(shí)間后停止加熱,靜置,取揮發(fā)油,加無(wú)水硫酸鈉過(guò)夜,過(guò)濾得纈草揮發(fā)油提取物備用,與微波輔助提取的纈草揮發(fā)油進(jìn)行抗氧化活性的比較。

        參照譚承佳等的微波輔助提取揮發(fā)油的方法[8]對(duì)纈草揮發(fā)油進(jìn)行提取。取適量纈草,將正己烷按一定比例加入圓底燒瓶?jī)?nèi),置于改良的微波爐腔內(nèi)。根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)定微波功率與時(shí)間,回流提取后冷卻至室溫,抽濾,收集濾液,適量濃縮,水浴蒸干得到微波提取物。再采用上述一般水蒸氣蒸餾法收集纈草揮發(fā)油,計(jì)算揮發(fā)油得率:

        1.2.2 單因素考察微波輔助提取工藝 本試驗(yàn)針對(duì)微波功率(150、300、450、600、750 W)、提取時(shí)間(10、15、20、25、30、35 min)、液料比(4 mL∶1 g、6 mL∶1 g、8 mL∶1 g、10 mL∶1 g、12 mL∶1 g)3個(gè)因素,保持其中2個(gè)變量固定不變,對(duì)另1個(gè)變量進(jìn)行單因素試驗(yàn),以揮發(fā)油提取率為指標(biāo),以確定Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)所需的水平范圍。

        1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)選纈草揮發(fā)油提取工藝在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取微波功率、提取時(shí)間、液料比3個(gè)對(duì)揮發(fā)油提取率影響較大的因素,用 Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken試驗(yàn),以揮發(fā)油提取率為指標(biāo)優(yōu)化提取工藝參數(shù),試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1、表2所示。

        表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

        表2 纈草揮發(fā)油提取的Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)指標(biāo)

        1.2.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參照 Kim等的方法[9]進(jìn)行DPPH自由基清除能力的測(cè)定。以無(wú)水乙醇為溶劑,將揮發(fā)油配制成濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液備用。精確吸取上述不同濃度的溶液300μL,與2 mL 0004%DPPH溶液充分混合后于室溫靜置20min,在517 nm處測(cè)其吸光度D517nm(1)。以不加提取液的DPPH為空白對(duì)照,以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)定溶液在517 nm處的吸光度D517nm(0)。精確吸取300μL上述不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)油溶液,分別與2 mL無(wú)水乙醇混合均勻后,以無(wú)水乙醇為對(duì)照,測(cè)定各溶液在517 nm處的吸光度D517nm(2)。用同樣的方法對(duì)水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算公式如下:

        1.2.5 鐵氰化鉀還原法測(cè)定還原力 參照劉水英等的方法[10]對(duì)還原力進(jìn)行測(cè)定。配制不同濃度的揮發(fā)油樣品溶液。取1.5 mL樣品,加入1.5 mL pH值6.6的磷酸鹽緩沖液和1.5 mL六氰合鐵酸鉀溶液,混勻后于50℃恒溫放置20 min,快速冷卻后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液,于3 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液再加入1 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵溶液,充分混勻并靜置后,于700 nm處測(cè)定吸光度,以吸光度表示還原能力,以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。用同樣的方法對(duì)水蒸氣蒸餾法提取的纈草揮發(fā)油的還原力進(jìn)行測(cè)定。

        1.2.6 羥自由基清除率 參照陳美珍等的方法[11-12]進(jìn)行羥自由基清除力的測(cè)定。配制不同濃度的揮發(fā)油樣品溶液,取1.5 mL樣品,分別加入 1.0 mL 2.5 mmol/L水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L FeSO4溶液和 2.0 mL蒸餾水,充分混勻,加入1.0 mL 5 mmol/L H2O2,先置于 37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min,再于510 nm處測(cè)定其吸光度,以蒸餾水作為空白參比,以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。用同樣的方法對(duì)水蒸氣蒸餾法提取的纈草揮發(fā)油的羥自由基清除率進(jìn)行測(cè)定,具體公式如下:

        式中:D510nm(0)為空白對(duì)照吸光度;D510nm(2)為加 H2O2樣品溶液吸光度;D510nm(1)為不加H2O2樣品溶液吸光度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素考察揮發(fā)油微波輔助提取工藝

        2.1.1 微波功率對(duì)揮發(fā)油提取率的影響 由圖1可知,隨著微波功率的增加,揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)微波功率為300W時(shí),揮發(fā)油提取率為(5.27±0.27)%。分析其原因,主要由于當(dāng)功率升高時(shí),溫度過(guò)高,低沸點(diǎn)物質(zhì)隨介質(zhì)沸騰而有所損失。因此,選定150~450 W為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的最佳水平。

        2.1.2 提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響 由圖2可知,隨著提取時(shí)間的增加,揮發(fā)油提取率呈先上升后穩(wěn)定在一定水平再下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為20~30 min時(shí),提取率穩(wěn)定在(4.75±0.16)%左右,當(dāng)繼續(xù)增加提取時(shí)間,揮發(fā)油被破壞或從介質(zhì)揮發(fā)從而出現(xiàn)提取率下降的趨勢(shì)。因此,選定15~30 min為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的提取時(shí)間范圍。

        2.1.3 液料比對(duì)揮發(fā)油提取率的影響 由圖3可知,隨著液料比的增加,揮發(fā)油提取率先上升后穩(wěn)定在一定水平,沒(méi)有明顯提高。當(dāng)液料比為8 mL∶1 g時(shí),提取率穩(wěn)定在(5.7±0.25)%左右。主要是因?yàn)樘崛∫旱脑黾涌墒估i草與提取溶劑充分接觸,有利于揮發(fā)油的浸出。當(dāng)液料比超過(guò)8mL∶1 g時(shí),揮發(fā)油的提取基本達(dá)到飽和狀態(tài)。因此,選定(6~10 mL)∶1 g為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的水平。

        2.2 Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化揮發(fā)油微波輔助提取工藝

        采用 Design-Expert8.0.6提供的 Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)各因素進(jìn)行擬合,得到多元回歸方程:

        R提取率=-6.100 5+0.043 7A+0.091 4B+0.832 3C-3.555 5×10-5AB+2.333 3×10-4AC+0.020 8BC-6.790 0×10-5A2-4.893 3×10-3B2-0.085 1C2。

        對(duì)揮發(fā)油提取率的回歸模型進(jìn)行方差及顯著性分析的結(jié)果見(jiàn)表3??梢钥闯?,該模型方程有極顯著影響(P<0.000 1),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.061 2>0.05),說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下,該回歸模型所考察的因素足以反映試驗(yàn)中各提取工藝參數(shù)對(duì)揮發(fā)油提取率的影響。R2=0.988 0=0.972 5,說(shuō)明回歸模型與試驗(yàn)值擬合均較好,可用于揮發(fā)油提取率的理論推測(cè)和分析,各因素影響大小依次為微波功率>提取時(shí)間>液料比。由F檢驗(yàn)結(jié)果可知,一次項(xiàng)中微波功率、提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油的提取率具有極顯著影響(P<001),交互項(xiàng)中提取時(shí)間與液料比之間的交互作用對(duì)揮發(fā)油提取率具有極顯著影響(P<0.01);在二次項(xiàng)中微波功率、提取時(shí)間、液料比均對(duì)揮發(fā)油提取率具有極顯著影響(P<001),其他因素之間影響不顯著。表3的結(jié)果與圖4中響應(yīng)面圖反映的各因素間的交互作用吻合。

        表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

        由Design-Expert8.0.6軟件得出,揮發(fā)油提取的最佳工藝參數(shù)是微波功率326.30 W、提取時(shí)間25.48 min、液料比8.57 mL∶1 g,在此條件下?lián)]發(fā)油的提取率為5.89%。為便于生產(chǎn)試驗(yàn)需求,設(shè)定微波功率為330 W,提取時(shí)間為25 min,液料比為8.6 mL∶1 g,進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得出揮發(fā)油提取率為(5.92±0.07)%。該值與預(yù)測(cè)值比較近,因此選取微波功率330W、提取時(shí)間25 min、液料比8.6 mL∶1 g作為微波輔助提取纈草揮發(fā)油的工藝參數(shù)。

        2.3 不同提取工藝提取的纈草揮發(fā)油抗氧化活性

        2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果 由圖5可知,水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除能力,且纈草揮發(fā)油濃度與DPPH清除率存在正相關(guān)關(guān)系,微波輔助提取的清除能力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當(dāng)纈草揮發(fā)油濃度為0.5 mg/mL時(shí),微波輔助提取法的清除率為80.9%,而水蒸氣蒸餾法的清除率為70.2%。

        2.3.2 還原力測(cè)定結(jié)果 吸光度與樣品的還原力具有正相關(guān)關(guān)系,吸光度越大,樣品的還原力越強(qiáng)。由圖6可知,水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發(fā)油均具有較強(qiáng)的還原能力,說(shuō)明該纈草揮發(fā)油也具有較強(qiáng)的抗氧化能力。在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),纈草揮發(fā)油的還原力隨著濃度的升高而增強(qiáng),且微波輔助提取的纈草揮發(fā)油還原力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當(dāng)纈草揮發(fā)油濃度為0.5 mg/mL時(shí),微波輔助提取法的吸光度為1.35。

        2.3.3 羥自由基清除率 由圖7可知,水蒸氣蒸餾法與微波輔助提取法得到的纈草揮發(fā)油對(duì)羥自由基均有較強(qiáng)的清除能力,隨著揮發(fā)油濃度的增加,清除率也隨之提高,微波輔助提取的清除能力明顯高于一般水蒸氣蒸餾法。當(dāng)纈草揮發(fā)油濃度為0.5 mg/mL時(shí),微波輔助提取法的清除率為78.9%,而水蒸氣蒸餾法的清除率為73.1%。

        3 結(jié)論

        響應(yīng)面法已廣泛應(yīng)用于化工、食品、農(nóng)林、冶金等各領(lǐng)域,具有試驗(yàn)次數(shù)少、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。本研究以纈草為主要原料,采用Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì),對(duì)其揮發(fā)油微波輔助提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)微波輔助提取的揮發(fā)油與一般水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油進(jìn)行抗氧化性能研究。結(jié)果表明,微波輔助提取揮發(fā)油的最佳工藝條件為微波功率330 W、提取時(shí)間25 min、液料比8.6 mL∶1 g,此條件下提取的纈草揮發(fā)油得率為(5.92±0.07)%。本試驗(yàn)揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定可行,提取率高,具有較強(qiáng)的還原能力,對(duì)DPPH自由基、羥自由基均有較強(qiáng)的清除能力,抗氧化能力與一般水蒸氣蒸餾法相比具有顯著差異。微波輔助提取是一種節(jié)能、高效、提取植物高品質(zhì)揮發(fā)油的新技術(shù),在植物開(kāi)發(fā)及食品研究中具有很好的應(yīng)用前景。

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