陳 杏，楊成麗，鮑炳鑫，張 璇，蒲姝瑾，張煦彤，李大力，石若夫

（南京理工大學(xué)生物工程系，江蘇南京210094）

β－葡萄糖苷酶屬于水解酶類，它能催化β－D－糖苷類物質(zhì)生成葡萄糖和糖苷配基。β－葡萄糖苷酶在生物體內(nèi)廣泛存在，包括細(xì)菌［1－2］、真菌［3－4］、植物［5－6］、動物［7－8］。β－葡萄糖苷酶在食品、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。β－葡萄糖苷酶不僅能水解食品中β－糖苷類的風(fēng)味前體物質(zhì)［9］，而且能制備多種藥物活性分子，如京尼平［10］、大豆異黃酮苷元［11］、人參皂苷［12］。此外，β－葡萄糖苷酶在纖維素生物質(zhì)的資源化領(lǐng)域有著不可替代的作用［13－14］。茶樹菇是一類具有大型子實體的可食性真菌。在茶樹菇的整個菌絲生長和出菇期間，分泌大量胞外β－葡萄糖苷酶，促進(jìn)菌絲細(xì)胞對纖維素等大分子物質(zhì)的降解和子實體的生長發(fā)育［15］。因此，茶樹菇是一種能分泌高產(chǎn)量、安全性高的β－葡萄糖苷酶的酶源。目前，還未見研究茶樹菇中β－葡萄糖苷酶的報道。我國是中藥大國，提取有效成分后的中藥殘渣一般含有豐富的粗纖維，但這些殘渣大多被當(dāng)作廢物垃圾處理。中草藥提取生物活性成分的加工過程包括碾碎［16］、堿處理［17］、有機溶劑處理［18］等，因此，通過生物催化方法降解中藥殘渣，可簡化預(yù)處理過程，而且得到的葡萄糖可作為一種重要的碳源，成為微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、甲醇的重要原料。本研究從茶樹菇中分離純化得到β－葡萄糖苷酶，并初步探索了茶樹菇β－葡萄糖苷酶和纖維素酶對提取喜樹堿后喜樹果渣的協(xié)同糖化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹菇子實體購自江蘇省南京市孝陵衛(wèi)農(nóng)貿(mào)市場，對硝基苯－β－D－葡萄糖苷（pNPG）購自Aladdin公司。其他試驗所用的試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。主要試驗設(shè)備為高速冷凍離心機（himac CR21G）、紫外－可見分光光度計（HITACHI）、數(shù)顯高速均質(zhì)機（杭州齊威儀器有限公司）、切向流超濾裝置（Millipore Pellicon－2）、制備電泳儀（BIO－RAD 491型）。

1.2 方法

1.2.1 茶樹菇β－葡萄糖苷酶的分離純化 稱取茶樹菇子實體，充分勻漿，紗布過濾得到濾過液，將濾過液于4℃、10 000 g下離心10 min，上清液即為粗酶液。依次使用截留分子量為500、10 ku的超濾膜進(jìn)行濃縮分離，得到的酶液經(jīng)40%～85%飽和度的硫酸銨分級沉淀后，透析。利用美國BIO－RAD 491型制備型電泳儀純化酶蛋白。以5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用磷酸緩沖液（50 mmol／L，pH值 7.0）洗脫。電泳過程在低溫下進(jìn)行，工作電壓為200 V。

將純化后的酶蛋白分別進(jìn)行Native－PAGE和SDSPAGE。Native－PAGE使用含0.05%的β－D－葡萄糖苷－4－甲基傘形酯的瓊脂覆蓋層染色［19］。

1.2.2 β－葡萄糖苷酶活性測定方法 在1 mL檸檬酸 －Na2HPO4緩沖液（50 mmol／L，pH值 6.0）中加入 100μL pNPG（8 mmol／L），再加入100μL酶液，50℃反應(yīng) 10 min，然后加入 1.5 mL Na2CO3（0.1 mmol／L）終止反應(yīng)，在 410 nm下測定吸光度的變化?？瞻讓φ沼谜麴s水代替酶液。酶活單位定義：在最適反應(yīng)條件下，1 min催化生成1μmol的對硝基苯酚所需要的酶量定為1個酶活單位（U）。

1.2.3 最適pH值和溫度的測定 配制不同pH值的檸檬酸 －Na2HPO4緩沖液，pH值為3.0～8.0，濃度為50 mmol／L，測定酶在不同pH值緩沖液中的酶活性以考察酶反應(yīng)的最適pH值。通過測定酶在不同溫度中的酶活性以考察酶反應(yīng)的最適溫度，溫度水平為20～80℃。

1.2.4 β－葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的測定 將β－葡萄糖苷酶分別放置在不同pH值的檸檬酸－Na2HPO4緩沖液（pH值5.0、6.0、8.0）中，于4、50℃保存不同時間（0～3 h），以 30 min為間隔取樣，在最適反應(yīng)條件下測定殘留酶活性。

1.2.5 β－葡萄糖苷酶動力學(xué)參數(shù)的測定 反應(yīng)體系中，加入 pNPG的終濃度為 6.67～666.7μmol／L，得到不同 pNPG濃度下的反應(yīng)速率。米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax根據(jù)試驗數(shù)據(jù)通過雙倒數(shù)作圖法求得。

1.2.6 茶樹菇β－葡萄糖苷酶與纖維素酶協(xié)同糖化提取喜樹堿后喜樹殘渣的研究 從成年喜樹上采集果實，曬干并粉碎成粉末，稱取10 g喜樹果實的粉末，加入100 mL 90%乙醇，在70℃下浸提1 h，將料液離心，回收殘渣，經(jīng)水洗、干燥后，作為糖化的原料。

以乙醇浸提的喜樹果實殘渣為原料，對β－葡萄糖苷酶與纖維素酶協(xié)同糖化作用進(jìn)行研究。在1.6 mL檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液（50 mmol／L，pH值 6.0）中，殘渣的濃度為0625%，同時加入纖維素酶（30 U）和β－葡萄糖苷酶（1 U），50℃下水解48 h，比較單酶法（纖維素酶）和雙酶法（β－葡萄糖苷酶與纖維素酶）處理殘渣時還原糖和葡萄糖含量隨時間的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 β－葡萄糖苷酶分離純化結(jié)果

經(jīng)分離純化得到的酶液Native－PAGE和SDS－PAGE結(jié)果如圖1所示。制備電泳純化的酶液經(jīng) Native－PAGE，β－葡萄糖苷酶活性區(qū)域在紫外線觀察下顯示為熒光條帶，將此凝膠進(jìn)一步使用考馬斯亮藍(lán)染色，出現(xiàn)單一條帶，說明得到了純化的β－葡萄糖苷酶。將制備電泳純化的酶液和蛋白分子量 Marker經(jīng) SDS－PAGE，并使用考馬斯亮藍(lán)染色，β－葡萄糖苷酶染色后出現(xiàn)單一條帶，與蛋白分子量Marker比較，β－葡萄糖苷酶的相對分子質(zhì)量為26 ku。

2.2 β－葡萄糖苷酶的最適pH值和溫度

pH值對酶活性的影響如圖2所示，β－葡萄糖苷酶在pH值6.0下酶活性最大，在pH值5.5～6.5范圍內(nèi)時，酶活性保持在85%以上，當(dāng)pH值＜5.5或者pH值＞6.5時，酶活性下降明顯。溫度對酶活性的影響如圖3所示，β－葡萄糖苷酶在50～55℃下表現(xiàn)出最大的催化反應(yīng)活性，在較低的溫度范圍（20～50℃）內(nèi)，β－葡萄糖苷酶的反應(yīng)速率隨溫度升高而增大，但當(dāng)溫度高于55℃后，酶活性急劇下降。

2.3 β－葡萄糖苷酶的pH值耐受性和溫度耐受性

如圖4所示，在pH值 6.0、4℃下，β－葡萄糖苷酶的酶活性基本不變。在最適反應(yīng)條件（pH值 6.0、50℃）下，1 h后，酶活性剩余80%以上；3 h后，酶活性剩余60%以上。在環(huán)境溫度為50℃下，β－葡萄糖苷酶在pH值6.0的耐受性高于 pH值5.0和 pH值8.0。

2.4 β－葡萄糖苷酶的動力學(xué)參數(shù)

β－葡萄糖苷酶對底物pNPG的水解反應(yīng)符合米氏方程，雙倒數(shù)作圖法計算得出米氏常數(shù)Km為0.114 mmol／L，最大反應(yīng)速率 Vmax為 10.96μmol／（L·min）。

2.5 茶樹菇β－葡萄糖苷酶與纖維素酶協(xié)同糖化喜樹殘渣

本試驗使用的原料為乙醇浸提喜樹堿后的喜樹果渣，研究茶樹菇β－葡萄糖苷酶與纖維素酶對其的協(xié)同糖化作用。圖5為單酶法和雙酶法水解喜樹果渣生成葡萄糖和還原糖的含量隨水解時間變化的情況。從圖5可知，雙酶水解48 h后，還原糖與葡萄糖的含量分別為 0.90、0.69 mg／mL，相比于單酶（纖維素酶）處理提高了39.17% 、48.15%。因此，以喜樹殘渣為原料酶法制備葡萄糖時，雙酶法相較于單酶法葡萄糖的生成量明顯增加。

3 討論與結(jié)論

茶樹菇β－葡萄糖苷酶的相對分子量為26 ku，最適溫度及最適pH值分別為50℃和6.0，在最適反應(yīng)條件下具有較好的溫度和pH值耐受性。以乙醇浸提喜樹堿后的喜樹果渣為原料，經(jīng)β－葡萄糖苷酶和纖維素酶的協(xié)同水解作用后，還原糖和葡萄糖的生成量有明顯增加。本試驗對中藥殘渣進(jìn)行了再利用，有利于解決殘渣堆積造成的環(huán)境污染問題，實現(xiàn)中藥殘渣的資源化和價值提升。

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