潘傳江，丁 杰，盛玉萍，王壽峰，劉 君

（四川理工學(xué)院分析測試中心，四川自貢643000）

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛹蟲草，廣東金草行；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品鑒定所。

儀器：L－2000高效液相色譜儀，日立（中國）有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；WBFY－205微波反應(yīng)器，鞏義市科瑞儀器有限公司；AS5150B超聲提取器，天津奧特塞恩斯儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩，成都市企航儀器有限公司；索氏提取器，鄭州興化玻璃儀器廠。

試劑：石油醚、苯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯均為成都科龍化工試劑廠生產(chǎn)的分析純試劑。乙腈、甲醇為色譜純，所用試驗用水均為去離子水。

1.2 蛹蟲草蟲草素的制備

取一定質(zhì)量的蛹蟲草，粉碎，過篩，經(jīng)石油醚脫脂，干燥處理后備用。準(zhǔn)確稱量一定量的蛹蟲草粉置于50 mL錐形瓶中，加入適量的按一定比例配制的提取溶液，放入微波－超聲波儀中萃取，微波頻率2 450 MHz，超聲波頻率40 kHz，一定時間后將提取溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，向錐形瓶中加入一定量的二氯甲烷，振蕩使其充分溶解，過濾，得到目標(biāo)產(chǎn)物。將目標(biāo)產(chǎn)物溶于50%甲醇溶液，定容后用于檢測分析［10］。

1.3 不同溶劑的考察

1.3.1 苯－無水乙醇 稱取備用蛹蟲草粗粉5.00 g，加4倍（體積質(zhì)量比）量的溶劑（苯 ∶無水乙醇＝9∶1）于錐形瓶微波－超聲提取50 min，趁熱抽濾，連續(xù)用5.0 mL無水乙醇洗濾渣2次，合并濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗過濾，濾液定容到250.0mL，用HPLC法測定蟲草素的含量。

1.3.2 甲苯－無水乙醇 稱取備用蛹蟲草粗粉5.00 g，加4倍（體積質(zhì)量比）量的溶劑（甲苯∶無水乙醇＝9∶1）于錐形瓶超聲提取50 min，趁熱抽濾，連續(xù)用5.0 mL無水乙醇洗濾渣2次，合并濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗過濾，濾液定容到250.0mL，用HPLC法測定蟲草素的含量。

1.3.3 環(huán)己烷－無水乙醇 稱取備用蛹蟲草粗粉5.00 g，加4倍（體積質(zhì)量比）量的溶劑（環(huán)己烷∶無水乙醇＝9∶1）于錐形瓶超聲提取50min，趁熱抽濾，連續(xù)用5 mL無水乙醇洗濾渣2次，合并濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗過濾，濾液定容到250.0 mL，用HPLC法測定蟲草素的含量。

1.3.4 乙酸乙酯－無水乙醇 稱取備用蛹蟲草粗粉5.00 g，加4倍（體積質(zhì)量比）量的溶劑（乙酸乙酯 ∶無水乙醇 ＝9∶1）于錐形瓶超聲提取50min，趁熱抽濾，連續(xù)用5.0mL無水乙醇洗濾渣2次，合并濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗過濾，濾液定容到250.0 mL，用HPLC法測定蟲草素的含量。

新建本科院校要改造圖書館的館風(fēng)，進(jìn)而改造學(xué)風(fēng)，是一項系統(tǒng)工程，既要從圖書館自身因素入手，也要改變外部因素。

1.3.5 二氯甲烷－無水乙醇 稱取備用蛹蟲草粗粉5.00 g，加4倍（體積質(zhì)量比）量的溶劑（二氯甲烷 ∶無水乙醇 ＝9∶1）于錐形瓶超聲提取50 min，趁熱抽濾，連續(xù)用5.0 mL無水乙醇洗濾渣2次，合并濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗過濾，濾液定容到250.0 mL，用HPLC法測定蟲草素的含量。

1.4 蛹蟲草蟲草素提取的正交試驗設(shè)計

選擇料液比（A）、提取溶劑比（B）、提取時間（C）、提取功率（D）4個因素，每個因素選取3個水平，考察4個因素對蛹蟲草中蟲草素提取率的影響，以蟲草素提取率作為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交試驗進(jìn)行篩選最佳方法（表1）。

表1 提取蛹蟲草蟲草素的正交試驗因素及水平

1.5 蛹蟲草蟲草素的檢測

1.5.1 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱量0.005 0 g蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至5.0 mL容量瓶中，定容，得到1.0 mg／mL的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用移液槍移取不同量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別稀釋成10、50、100、150、200μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，冷藏待用。

1.5.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱量一定量經(jīng)脫脂后的蛹蟲草粉于一體化反應(yīng)器中，按料液比 1 g∶4 mL，溶劑甲苯∶無水乙醇為10 mL∶1 mL，提取時間為50 min，提取功率為60W，置于微波－超聲波協(xié)同提取儀中，將儀器超聲波打開，在選定的微波功率下提取，一定時間后將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，加入一定量的二氯甲烷，振蕩使其充分溶解，過濾，得到目標(biāo)產(chǎn)物。將目標(biāo)產(chǎn)物溶于50%甲醇溶液，定容后用于檢測分析。

1.5.3 HPLC色譜條件 色譜柱為 ZORBAX Extend－C18柱（Analytical 4.6×250 nm 5－Micron 80 A），流動相為水 ∶甲醇 ＝95∶5，洗脫速率為 1.00 mL／min，柱溫 35℃，進(jìn)樣量為10μL。

1.5.4 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照“1.5.1”節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液，得到10、50、100、150、200μg／mL不同濃度的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照“1.5.3”節(jié)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，測得峰面積S，以峰面積 S對濃度 C（mg／mL）作圖，得到回歸方程：y＝33 054x－41 890（r＝0.999），表明在 10～200μg／mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按信噪比3倍（S／N）計算，得到蟲草素的檢出限（LOD）為1μg／mL。

1.5.5 蛹蟲草中蟲草素含量計算

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草素HPLC檢測波長的確定

紫外分光光度法全波長掃描蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定蟲草素的紫外吸收光譜，從圖1可以看出，蟲草素在259 nm處出現(xiàn)最大吸收，因此選擇HPLC的檢測波長為259 nm。

2.2 HPLC流動相的選擇

在試驗過程先后選用KH2PO4緩沖溶液加四氫呋喃、水－乙腈、水－甲醇作為流動相，比較各條件的分離效果，選擇最佳流動相。選用KH2PO4緩沖溶液加四氫呋喃作為流動相進(jìn)樣測定時，經(jīng)過幾次進(jìn)樣試驗后，發(fā)現(xiàn)峰形逐漸變寬，經(jīng)計算可知C18柱的柱效、理論塔板數(shù)都快速降低，要經(jīng)過大量乙腈和甲醇沖洗活化后，才能使柱子勉強(qiáng)恢復(fù)到以前的效果。可見緩沖溶液對該柱子的損害作用很大，因此，KH2PO4緩沖溶液加四氫呋喃不宜作為流動相。當(dāng)用水－乙腈作為流動相時，蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品和腺苷標(biāo)準(zhǔn)品雖然出峰時間比較短，但峰形很差且分離效果不佳。當(dāng)水∶乙腈＝1∶9時，腺苷和蟲草素的保留時間非常小且2個峰靠得很近，不能完全分開，彼此之間干擾較大，不適合用作分離的流動相。當(dāng)增加或減少水的比例，2個標(biāo)準(zhǔn)品仍不能有效分離。而當(dāng)用水和甲醇作為流動相時，蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品和腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間略有延長，分離效果較好，且峰形窄而對稱。用水∶甲醇體積比為9∶1作流動相保留時間出在可信度較高區(qū)域，但2個標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果不是很好，當(dāng)繼續(xù)增大水的比例時，2個峰的分離度越來越高；當(dāng)比例達(dá)到19∶1時，雖然保留時間稍有增加，但峰完全分離開且峰形對稱尖銳、檢測靈敏度高（圖2）。當(dāng)降低水的比例時蟲草素后面有明顯的拖尾，2個峰不能分離；而再加大水的比例雖然分離度稍好但保留時間延后很多，浪費時間、試劑，故選擇水∶甲醇體積比為19∶1作為流動相。

試驗結(jié)果表明，中性條件下分離效果較佳且色譜純有機(jī)溶劑用量少、操作簡便，且利于色譜柱的保護(hù)，使用壽命更長，有利于節(jié)約成本。色譜柱：ZORBAX Extend－C18柱（Analytical 4.6×250 nm 5－Micron 80 A）；柱溫為35℃；流速為1 mL／min；流動相為甲醇 ∶水（體積比）＝1∶19；每次進(jìn)樣10μL；檢測器檢測波長259 nm。采用峰面積外標(biāo)法定量。在此流動相條件下，對蛹蟲草子實體提取液進(jìn)行測定，蟲草素與樣品中其他雜質(zhì)能夠有效分開，無干擾，出峰時間適宜，分析穩(wěn)定，分離效果見圖3。由于子實體中含有的腺苷和蟲草素的結(jié)構(gòu)極其相似，在相同色譜條件下進(jìn)樣腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（圖4）。從圖2、圖3、圖4比較可見，腺苷和蟲草素的分離度相當(dāng)大。

2.3 HPLC法繪制蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照以上色譜條件進(jìn)樣測定“1.5.1”節(jié)所配標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄測定的蟲草素峰對應(yīng)的面積S，以峰面積S對濃度C（μg／mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2、圖5）。通過線性回歸得到回歸方程：y＝33 054x－41 890，線性相關(guān)系數(shù)為 r＝0.999，表明在10～200μg／mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按信噪比3倍（S／N）計算，得到蟲草素的檢出限（LOD）為1μg／mL。

表2 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

2.4 蟲草素提取溶劑的選擇

以蟲草素提取率為指標(biāo)，對蟲草素提取所用有機(jī)溶劑配比的選擇進(jìn)行研究，粗提液定容到250.0mL，通過HPLC檢測，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蟲草素的含量，平行3次檢測求平均值（表3）。

從表3可以看出，相對于其他溶劑和無水乙醇配比而言，甲苯、苯與無水乙醇配比作為提取劑，蟲草素的溶出量較高；相較于單獨的無水乙醇或去離子水，蟲草素的溶出量也高出許多。這可能是由于在調(diào)節(jié)提取劑極性的同時在結(jié)構(gòu)上也有相似的地方，蟲草素有一個類似于苯環(huán)的六元環(huán)，根據(jù)相似相容原理，增加了蟲草素的溶出；無水乙醇、水極性較大，對于本身極性較大的蟲草素也有較好溶出效果，但是相比甲苯和苯與無水乙醇配比作為提取劑時還是相差較大，而且當(dāng)用水或無水乙醇做提取劑時，同時被溶出的雜質(zhì)含量較高，不利于蟲草素更好地溶出；而其他幾種常見有機(jī)溶劑作為提取劑時對體系可能只起到調(diào)節(jié)極性或一些影響較小的作用，這些因素占了提取劑大量比例而不利于蟲草素的溶出。提取劑選用甲苯或苯與無水乙醇配比時蟲草素的溶出量相差不大，但在甲苯和苯之間，相較而言，苯的毒性更大，吸入人體后不能被排解，對人體傷害更大，且價格更昂貴，故選擇甲苯與無水乙醇配比作為提取劑。

表3 不同提取溶劑蟲草素提取率

2.5 蛹蟲草蟲草素的最佳提取條件正交試驗

超聲－微波協(xié)同提取蛹蟲草蟲草素的正交試驗各處理的蟲草素提取率結(jié)果見表4。4因素極差值R的大小依次為A＞C＞B＞D，即各因素對蟲草素提取率影響大小順序為料液比＞提取時間＞溶劑比＞微波功率。

通過k值確定其最優(yōu)水平為A3B3C2D3，即料液比為1 g∶5 mL，溶劑比為19mL∶1mL，提取時間為50min，微波功率為60W。在該最優(yōu)條件下試驗，其提取率為0.27%，提取率高于單因素結(jié)果，說明優(yōu)化試驗條件后其提取率得到提高。重復(fù)進(jìn)行5次試驗，其RSD為3.79%，重復(fù)性好，方案穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

本試驗利用微波－超聲波法提取蛹蟲草中蟲草素，利用HPLC繪制蟲草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝33 054x－41 890，r＝0.999，在10～200μg／mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。LOD：1μg／mL。對比了一系列提取劑對蛹蟲草中蟲草素提取的影響，發(fā)現(xiàn)用甲苯和水作為提取劑時效果最好，甲苯和高純水的最佳配比為19 mL∶1 mL。通過正交試驗得到其最佳提取條件為料液比為1 g∶5 mL，溶劑比為19 mL∶1 mL，提取時間為50 min，微波功率為60 W，在該條件下蛹蟲草蟲草素的提取率為0.27%。不同因素對蟲草素提取貢獻(xiàn)的大小順序為料液比＞提取時間＞溶劑比＞微波功率。本試驗過程中，結(jié)合超聲波－微波協(xié)同處理蛹蟲草提取蟲草素，利用微波的高能作用和超聲波的空化作用有助于提高蟲草素的產(chǎn)量。

表4 超聲－微波協(xié)同提取蛹蟲草蟲草素正交試驗設(shè)計及結(jié)果

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