張文明,巢建國(guó),谷 巍,陸奇杰,侯皓然
(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京210023)
茅蒼術(shù)[Atractylodes lancea(Thunb.)DC.]為菊科多年生草本,其根莖具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目之功效[1]。近年來,由于種種環(huán)境脅迫和人為因素等對(duì)茅蒼術(shù)的品質(zhì)和資源儲(chǔ)量造成了嚴(yán)重影響,已被江蘇省列為珍稀瀕危藥用植物之一。曾燕等研究結(jié)果表明,30℃以上的高溫脅迫會(huì)限制茅蒼術(shù)的生長(zhǎng),但有利于其主要活性成分揮發(fā)油的積累[2]。顧永華等研究結(jié)果表明,果后期對(duì)茅蒼術(shù)進(jìn)行適宜的澇漬脅迫有利于提高其根莖生長(zhǎng)及揮發(fā)油含量[3]。目前,對(duì)茅蒼術(shù)這些抗逆機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。因此,從蛋白質(zhì)角度能更好了解逆境對(duì)茅蒼術(shù)各種生化和信號(hào)途徑的影響[4],對(duì)弄清茅蒼術(shù)的一系列抗逆分子機(jī)制具有重要意義。而蛋白質(zhì)的提取是茅蒼術(shù)蛋白質(zhì)水平研究的重要一步,對(duì)這方面研究尚未報(bào)道。本試驗(yàn)以茅蒼術(shù)葉片為原料,對(duì)茅蒼術(shù)葉片蛋白質(zhì)的提取方法及工藝條件進(jìn)行研究,并運(yùn)用SDS-PAGE法對(duì)其進(jìn)行分析,在此基礎(chǔ)上建立適宜茅蒼術(shù)葉片蛋白提取和SDS-PAGE的一套方法,以期為茅蒼術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考依據(jù)。
試驗(yàn)材料為江蘇省鎮(zhèn)江茅山地區(qū)的茅蒼術(shù),種植于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園內(nèi)。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系巢建國(guó)教授鑒定為菊科植物茅蒼術(shù)。
彩虹245廣譜蛋白Maker,膽酰胺基丙基二甲基銨基丙磺酸鹽(CHAPS),乙二胺四乙酸(EDTA),聚乙烯吡咯烷酮(PVP,北京索萊寶科技有限公司);二硫蘇糖醇(DTT,上海阿拉丁生化科技有限公司);牛血清白蛋白(上?;菖d生化試劑有限公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris),鹽酸(HCl)等試劑均為分析純,水為雙蒸水。
Mini Trans-BlotCell型電泳槽和 PowerPac Basic系列電泳儀,美國(guó)Bio-Rad公司;UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;SIGMA3-18K高速冷凍離心機(jī),北京博勱行儀器有限公司;Tanon-5200Multi多功能成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司。
1.3.1 直接提取法 取0.2 g茅蒼術(shù)葉片,按其鮮質(zhì)量的10%加入 PVP,按 1 g∶1 mL加入蛋白提取液(50 mmol/L Tris-HCl,pH值 7.0),在 0℃ 低溫下研碎,于 4℃、12 000 r/min離心 20 min,取上清液作為待測(cè)蛋白上樣液[5]。
1.3.2 TCA-丙酮法 取0.2 g茅蒼術(shù)葉片加入液氮研磨完全,加入2 mL預(yù)冷的含體積分?jǐn)?shù)10%TCA、0.07%β-巰基乙醇(β-Me)丙酮溶液,混勻完全后于-20℃靜置2 h,4℃、12 000 r/min離心20min,棄上清液。于沉淀物中加入2mL含0.07%β-Me預(yù)冷丙酮溶液,在-20℃下靜置2 h,于4℃、12 000 r/min條件下離心20 min,重復(fù)漂洗2次。最后加入2 mL預(yù)冷的80%丙酮溶液洗滌沉淀物,在4℃、12 000 r/min條件下離心20min,于-20℃下?lián)]干,即得蛋白粉末[6]。
1.3.3 Tris-丙酮法 取0.2 g茅蒼術(shù)葉片于液氮中研磨完全,立即加入 2 mL提取緩沖液[0.04 mol/L Tris-base,5 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、20 mg/mL CHAPS、50 mg/mL PVP,20 mg/mLβ-Me],完全混勻后在 4℃、12 000 r/min離心20 min,取上清液,加入4倍體積預(yù)冷的含 0.07% β-Me的丙酮溶液進(jìn)行漂洗,在-20℃冰箱中靜置2 h后于4℃、12 000 r/min下離心20 min,得沉淀,然后用預(yù)冷的含0.07%β-Me丙酮溶液漂洗沉淀,振蕩混勻,-20℃下靜置2 h,于4℃、12 000 r/min下離心20 min,收集沉淀,重復(fù)漂洗3次。收集的沉淀物在-20℃下?lián)]干,即得蛋白粉末[7-8]。
1.3.4 Tris-飽和酚法 稱取0.2 g茅蒼術(shù)葉片加液氮充分研磨,加 1 mL蛋白提取液[0.1 mol/L Tris-HCl(pH值8.8)、0.01 mol/L EDTA、4%β-Me、0.9 mol/L蔗糖]和 1 mL Tris-飽和酚(pH值8.5),研磨30 s,轉(zhuǎn)入離心管。4℃混勻,于4℃、12 000 r/min離心20 min。取上層酚相0.4 mL至無菌離心管中,加入4倍體積預(yù)冷的含0.1 mol/L的乙酸銨甲醇溶液,混勻,-20℃放置2 h,4℃、12 000 r/min離心20min,棄上清。沉淀依次用預(yù)冷的含 0.1 mol/L乙酸銨、0.01 mol/L DTT的甲醇溶液和預(yù)冷的含0.01 mol/L DTT的80%甲醇溶液各清洗2次,所得沉淀 -20℃ 揮干,即得蛋白粉末[9-10]。
分別取上述提取所得的蛋白粉末70 mg,加入700μL裂解液(8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、40 mg/mL CHAPS、1%DTT),在25℃超聲清洗器中超聲處理,每次5 min,間隔期間振蕩30 s,超聲處理 40 min后,于 4℃、12 000 r/min離心20 min,移取上清液至新的離心管,即為待測(cè)蛋白上樣液[8]。用Bradford法[11]作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蛋白含量。
用PowerPac Basic系列電泳儀進(jìn)行SDS-PAGE分析,分離膠濃度12%,濃縮膠濃度5%,電極緩沖液為pH值8.8的Tris-甘氨酸緩沖液。將待測(cè)蛋白上樣液與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(6×)混勻后,100℃加熱5 min,以充分變性蛋白。每條泳道上樣量均是20μL,先于90 V恒壓電泳30min,再120 V恒壓電泳約60 min,當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距膠板下緣約1 cm時(shí)結(jié)束電泳。凝膠板浸于0.1%考馬斯亮藍(lán)R250中染色約2 h,再換成脫色液,搖床上脫色至背景基本無色。
膠板用Tanon-5200Multi多功能成像系統(tǒng)拍照,使用Quantity One軟件進(jìn)行圖譜分析。
對(duì)4種蛋白質(zhì)提取方法得到的茅蒼術(shù)葉片蛋白的呈現(xiàn)形式、顏色、提取時(shí)間、蛋白含量進(jìn)行比較,從表1可以看出,直接提取法雖然耗時(shí)較短,但是所得終產(chǎn)物顏色是綠色,蛋白含量偏低,可能是由于茅蒼術(shù)葉片含有較多色素未被完全分解;TCA-丙酮法、Tris-丙酮法蛋白含量較高,但提取時(shí)間過長(zhǎng),操作繁瑣。同時(shí),TCA-丙酮法提取的蛋白經(jīng)多次漂洗后顏色仍呈淡黃色,這可能是由于茅蒼術(shù)葉片中的某些成分和蛋白共沉淀,造成提取的蛋白不純。Tris-飽和酚法加入裂解液后易溶解,提取的蛋白揮干后呈白色,對(duì)非蛋白物質(zhì)去除有很好的效果,且提取時(shí)間相對(duì)較短。
以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,待測(cè)蛋白上樣液濃度采用Bradford法作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蛋白含量,標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。測(cè)得TCA-丙酮法提取獲得的蛋白干粉質(zhì)量為(3.05±0.133)g、Tris-丙酮法提取獲得的蛋白干粉質(zhì)量為(4.23±0.098)g、Tris-飽和酚法提取所獲得的蛋白干粉質(zhì)量為(3.31±0923)g,表明3種提取方法在蛋白干粉質(zhì)量上沒有達(dá)到明顯差異。
表1 不同提取方法對(duì)茅蒼術(shù)葉片蛋白終產(chǎn)物的影響
從圖2可以看出,直接提取法、TCA-丙酮法有8、7條標(biāo)準(zhǔn)蛋白譜帶,蛋白條帶均著色較淺,且小分子蛋白條帶缺失嚴(yán)重,均不適合茅蒼術(shù)葉片的電泳分析。Tris-丙酮法獲得的標(biāo)準(zhǔn)蛋白譜帶為11條,背景顏色較為清晰,條帶亦可清楚辨認(rèn),但在25~80 ku范圍內(nèi)缺失部分蛋白,測(cè)得蛋白種類不全。Tris-飽和酚法獲得的標(biāo)準(zhǔn)蛋白譜帶為14條,與Tris-丙酮法的蛋白譜帶模式相似,在17~245 ku的范圍內(nèi)分布較為均勻,條帶可清晰辨別。
理想蛋白樣品的制備在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中具有重要作用,同時(shí)由于植物個(gè)體、器官、組織化學(xué)成分等差異造成其蛋白提取方法各不相同[12-13]。本研究從蛋白含量、純度、提取時(shí)間方面,運(yùn)用SDS-PAGE技術(shù)對(duì)茅蒼術(shù)葉片蛋白提取方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明,不同提取方法得到的蛋白純度和含量有明顯不同,對(duì)蛋白條帶的形成產(chǎn)生了直接影響。直接提取法雖然提取時(shí)間最短,但其蛋白含量和純度較低,條帶著色淺難以鑒別。TCA-丙酮法耗時(shí)最長(zhǎng),得到的蛋白沉淀為淡黃色,溶解性較差,可能是由于高含量的蛋白中摻入了較多雜質(zhì)。Tris-丙酮法提取蛋白純度較高,且譜帶背景清晰,但在25~80 ku范圍內(nèi)缺失部分蛋白,可能是由于CHAPS與蛋白結(jié)合后未能去除完全的原因。Tris-飽和酚法提取的蛋白條帶和Tris-丙酮法相比雖然背景色較深,但在17~245 ku范圍內(nèi)分布較為均勻,條帶仍可清晰辨別。其次在提取時(shí)間和蛋白純度上Tris-飽和酚法均有良好效果,這與飽和酚的性質(zhì)有很大關(guān)系。飽和酚良好的溶解性,能使茅蒼術(shù)葉片中可溶性雜質(zhì)溶解在水中,而蛋白質(zhì)和脂類溶解在飽和酚中,同時(shí)利用乙酸銨甲醇溶液對(duì)其沉淀純化,亦避免新離子的加入[14],更適合茅蒼術(shù)葉片蛋白質(zhì)的提取。本研究結(jié)果可為逆境脅迫下茅蒼術(shù)分子機(jī)制在蛋白質(zhì)水平下的變化研究提供基礎(chǔ)資料。
參考文獻(xiàn):
[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:204.
[2]曾 燕,郭蘭萍,陳保冬,等.不同溫度對(duì)茅蒼術(shù)生長(zhǎng)發(fā)育及揮發(fā)油組分的影響[J].世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化),2010,12(5):773-778.
[3]顧永華,馮 煦,夏 冰.水分脅迫對(duì)茅蒼術(shù)根莖生長(zhǎng)及揮發(fā)油含量的影響[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2008,17(3):23-27.
[4]陳 飛,周 彤,魏宇佳,等.茅蒼術(shù)質(zhì)膜蛋白的制備及其雙向電泳蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)的構(gòu)建[J].生物技術(shù)通報(bào),2016,32(9):72-82.
[5]谷瑞升,劉群錄,陳雪梅,等.木本植物蛋白提取和SDS-PAGE分析方法的比較和優(yōu)化[J].植物學(xué)通報(bào),1999,16(2):171-177.
[6]華貴煌,董 燕,易 浪,等.魚腥草葉片總蛋白的提取及雙向電泳體系的建立[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)報(bào),2013,30(3):375-378.
[7]Xiang F,Xu L,Wang Y,et al.Effective method of leaf protein extraction for proteomic analysis in radish[J].Molecular Plant Breeding,2012,10(6):756-760.
[8]陳富成,祁建民,徐建堂,等.圓果種黃麻功能葉總蛋白提取方法及雙向電泳體系的優(yōu)化[J].作物學(xué)報(bào),2011,37(2):369-373.
[9]張 寧,孫曉麗,端木慧子,等.野生大豆葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化研究[J].大豆科學(xué),2015,34(5):874-880.
[10]劉 楠,高 飛,周宜君,等.蒙古沙冬青根蛋白的提取及雙向電泳體系的建立[J].北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,49(4):365-368.
[11]丁金鵬,張 娜,李 群.獨(dú)行菜屬植物種子總蛋白4種提取方法的比較[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,54(7):1305-1312.
[12]沈少炎,吳玉香,榮俊冬,等.兩種花吊絲竹葉片蛋白提取方法的2-DE比較[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2017,46(1):50-57.
[13]Alam M,Ghosh W.Optimization of a phenol extraction-based protein preparation method amenable to downstream 2-DE and MALDI-MSbased analysis of bacterial proteomes[J].Proteomics,2014,14(2/3):216-221.
[14]高 芳.雪蓮組織中蛋白質(zhì)提取方法比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(15):32-34.