張文明，巢建國(guó)，谷 巍，陸奇杰，侯皓然

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023）

茅蒼術(shù)［Atractylodes lancea（Thunb.）DC.］為菊科多年生草本，其根莖具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目之功效［1］。近年來，由于種種環(huán)境脅迫和人為因素等對(duì)茅蒼術(shù)的品質(zhì)和資源儲(chǔ)量造成了嚴(yán)重影響，已被江蘇省列為珍稀瀕危藥用植物之一。曾燕等研究結(jié)果表明，30℃以上的高溫脅迫會(huì)限制茅蒼術(shù)的生長(zhǎng)，但有利于其主要活性成分揮發(fā)油的積累［2］。顧永華等研究結(jié)果表明，果后期對(duì)茅蒼術(shù)進(jìn)行適宜的澇漬脅迫有利于提高其根莖生長(zhǎng)及揮發(fā)油含量［3］。目前，對(duì)茅蒼術(shù)這些抗逆機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。因此，從蛋白質(zhì)角度能更好了解逆境對(duì)茅蒼術(shù)各種生化和信號(hào)途徑的影響［4］，對(duì)弄清茅蒼術(shù)的一系列抗逆分子機(jī)制具有重要意義。而蛋白質(zhì)的提取是茅蒼術(shù)蛋白質(zhì)水平研究的重要一步，對(duì)這方面研究尚未報(bào)道。本試驗(yàn)以茅蒼術(shù)葉片為原料，對(duì)茅蒼術(shù)葉片蛋白質(zhì)的提取方法及工藝條件進(jìn)行研究，并運(yùn)用SDS－PAGE法對(duì)其進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上建立適宜茅蒼術(shù)葉片蛋白提取和SDS－PAGE的一套方法，以期為茅蒼術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為江蘇省鎮(zhèn)江茅山地區(qū)的茅蒼術(shù)，種植于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園內(nèi)。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系巢建國(guó)教授鑒定為菊科植物茅蒼術(shù)。

彩虹245廣譜蛋白Maker，膽酰胺基丙基二甲基銨基丙磺酸鹽（CHAPS），乙二胺四乙酸（EDTA），聚乙烯吡咯烷酮（PVP，北京索萊寶科技有限公司）；二硫蘇糖醇（DTT，上海阿拉丁生化科技有限公司）；牛血清白蛋白（上?；菖d生化試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris），鹽酸（HCl）等試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.2 儀器設(shè)備

Mini Trans－BlotCell型電泳槽和 PowerPac Basic系列電泳儀，美國(guó)Bio－Rad公司；UV－1800PC紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SIGMA3－18K高速冷凍離心機(jī)，北京博勱行儀器有限公司；Tanon－5200Multi多功能成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.3 蛋白質(zhì)提取方法

1.3.1 直接提取法 取0.2 g茅蒼術(shù)葉片，按其鮮質(zhì)量的10%加入 PVP，按 1 g∶1 mL加入蛋白提取液（50 mmol／L Tris－HCl，pH值 7.0），在 0℃ 低溫下研碎，于 4℃、12 000 r／min離心 20 min，取上清液作為待測(cè)蛋白上樣液［5］。

1.3.2 TCA－丙酮法 取0.2 g茅蒼術(shù)葉片加入液氮研磨完全，加入2 mL預(yù)冷的含體積分?jǐn)?shù)10%TCA、0.07%β－巰基乙醇（β－Me）丙酮溶液，混勻完全后于－20℃靜置2 h，4℃、12 000 r／min離心20min，棄上清液。于沉淀物中加入2mL含0.07%β－Me預(yù)冷丙酮溶液，在－20℃下靜置2 h，于4℃、12 000 r／min條件下離心20 min，重復(fù)漂洗2次。最后加入2 mL預(yù)冷的80%丙酮溶液洗滌沉淀物，在4℃、12 000 r／min條件下離心20min，于－20℃下?lián)]干，即得蛋白粉末［6］。

1.3.3 Tris－丙酮法 取0.2 g茅蒼術(shù)葉片于液氮中研磨完全，立即加入 2 mL提取緩沖液［0.04 mol／L Tris－base，5 mol／L尿素、2 mol／L硫脲、20 mg／mL CHAPS、50 mg／mL PVP，20 mg／mLβ－Me］，完全混勻后在 4℃、12 000 r／min離心20 min，取上清液，加入4倍體積預(yù)冷的含 0.07% β－Me的丙酮溶液進(jìn)行漂洗，在－20℃冰箱中靜置2 h后于4℃、12 000 r／min下離心20 min，得沉淀，然后用預(yù)冷的含0.07%β－Me丙酮溶液漂洗沉淀，振蕩混勻，－20℃下靜置2 h，于4℃、12 000 r／min下離心20 min，收集沉淀，重復(fù)漂洗3次。收集的沉淀物在－20℃下?lián)]干，即得蛋白粉末［7－8］。

1.3.4 Tris－飽和酚法 稱取0.2 g茅蒼術(shù)葉片加液氮充分研磨，加 1 mL蛋白提取液［0.1 mol／L Tris－HCl（pH值8.8）、0.01 mol／L EDTA、4%β－Me、0.9 mol／L蔗糖］和 1 mL Tris－飽和酚（pH值8.5），研磨30 s，轉(zhuǎn)入離心管。4℃混勻，于4℃、12 000 r／min離心20 min。取上層酚相0.4 mL至無菌離心管中，加入4倍體積預(yù)冷的含0.1 mol／L的乙酸銨甲醇溶液，混勻，－20℃放置2 h，4℃、12 000 r／min離心20min，棄上清。沉淀依次用預(yù)冷的含 0.1 mol／L乙酸銨、0.01 mol／L DTT的甲醇溶液和預(yù)冷的含0.01 mol／L DTT的80%甲醇溶液各清洗2次，所得沉淀 －20℃ 揮干，即得蛋白粉末［9－10］。

1.4 蛋白提取液的裂解和含量測(cè)定

分別取上述提取所得的蛋白粉末70 mg，加入700μL裂解液（8 mol／L尿素、2 mol／L硫脲、40 mg／mL CHAPS、1%DTT），在25℃超聲清洗器中超聲處理，每次5 min，間隔期間振蕩30 s，超聲處理 40 min后，于 4℃、12 000 r／min離心20 min，移取上清液至新的離心管，即為待測(cè)蛋白上樣液［8］。用Bradford法［11］作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蛋白含量。

1.5 凝膠制備

用PowerPac Basic系列電泳儀進(jìn)行SDS－PAGE分析，分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，電極緩沖液為pH值8.8的Tris－甘氨酸緩沖液。將待測(cè)蛋白上樣液與SDS－PAGE蛋白上樣緩沖液（6×）混勻后，100℃加熱5 min，以充分變性蛋白。每條泳道上樣量均是20μL，先于90 V恒壓電泳30min，再120 V恒壓電泳約60 min，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距膠板下緣約1 cm時(shí)結(jié)束電泳。凝膠板浸于0.1%考馬斯亮藍(lán)R250中染色約2 h，再換成脫色液，搖床上脫色至背景基本無色。

1.6 圖像分析

膠板用Tanon－5200Multi多功能成像系統(tǒng)拍照，使用Quantity One軟件進(jìn)行圖譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法蛋白終產(chǎn)物的比較

對(duì)4種蛋白質(zhì)提取方法得到的茅蒼術(shù)葉片蛋白的呈現(xiàn)形式、顏色、提取時(shí)間、蛋白含量進(jìn)行比較，從表1可以看出，直接提取法雖然耗時(shí)較短，但是所得終產(chǎn)物顏色是綠色，蛋白含量偏低，可能是由于茅蒼術(shù)葉片含有較多色素未被完全分解；TCA－丙酮法、Tris－丙酮法蛋白含量較高，但提取時(shí)間過長(zhǎng)，操作繁瑣。同時(shí)，TCA－丙酮法提取的蛋白經(jīng)多次漂洗后顏色仍呈淡黃色，這可能是由于茅蒼術(shù)葉片中的某些成分和蛋白共沉淀，造成提取的蛋白不純。Tris－飽和酚法加入裂解液后易溶解，提取的蛋白揮干后呈白色，對(duì)非蛋白物質(zhì)去除有很好的效果，且提取時(shí)間相對(duì)較短。

2.2 不同提取方法所得蛋白含量的比較

以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，待測(cè)蛋白上樣液濃度采用Bradford法作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。測(cè)得TCA－丙酮法提取獲得的蛋白干粉質(zhì)量為（3.05±0.133）g、Tris－丙酮法提取獲得的蛋白干粉質(zhì)量為（4.23±0.098）g、Tris－飽和酚法提取所獲得的蛋白干粉質(zhì)量為（3.31±0923）g，表明3種提取方法在蛋白干粉質(zhì)量上沒有達(dá)到明顯差異。

表1 不同提取方法對(duì)茅蒼術(shù)葉片蛋白終產(chǎn)物的影響

2.3 不同提取方法SDS－PAGE電泳圖譜分析

從圖2可以看出，直接提取法、TCA－丙酮法有8、7條標(biāo)準(zhǔn)蛋白譜帶，蛋白條帶均著色較淺，且小分子蛋白條帶缺失嚴(yán)重，均不適合茅蒼術(shù)葉片的電泳分析。Tris－丙酮法獲得的標(biāo)準(zhǔn)蛋白譜帶為11條，背景顏色較為清晰，條帶亦可清楚辨認(rèn)，但在25～80 ku范圍內(nèi)缺失部分蛋白，測(cè)得蛋白種類不全。Tris－飽和酚法獲得的標(biāo)準(zhǔn)蛋白譜帶為14條，與Tris－丙酮法的蛋白譜帶模式相似，在17～245 ku的范圍內(nèi)分布較為均勻，條帶可清晰辨別。

3 討論與結(jié)論

理想蛋白樣品的制備在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中具有重要作用，同時(shí)由于植物個(gè)體、器官、組織化學(xué)成分等差異造成其蛋白提取方法各不相同［12－13］。本研究從蛋白含量、純度、提取時(shí)間方面，運(yùn)用SDS－PAGE技術(shù)對(duì)茅蒼術(shù)葉片蛋白提取方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，不同提取方法得到的蛋白純度和含量有明顯不同，對(duì)蛋白條帶的形成產(chǎn)生了直接影響。直接提取法雖然提取時(shí)間最短，但其蛋白含量和純度較低，條帶著色淺難以鑒別。TCA－丙酮法耗時(shí)最長(zhǎng)，得到的蛋白沉淀為淡黃色，溶解性較差，可能是由于高含量的蛋白中摻入了較多雜質(zhì)。Tris－丙酮法提取蛋白純度較高，且譜帶背景清晰，但在25～80 ku范圍內(nèi)缺失部分蛋白，可能是由于CHAPS與蛋白結(jié)合后未能去除完全的原因。Tris－飽和酚法提取的蛋白條帶和Tris－丙酮法相比雖然背景色較深，但在17～245 ku范圍內(nèi)分布較為均勻，條帶仍可清晰辨別。其次在提取時(shí)間和蛋白純度上Tris－飽和酚法均有良好效果，這與飽和酚的性質(zhì)有很大關(guān)系。飽和酚良好的溶解性，能使茅蒼術(shù)葉片中可溶性雜質(zhì)溶解在水中，而蛋白質(zhì)和脂類溶解在飽和酚中，同時(shí)利用乙酸銨甲醇溶液對(duì)其沉淀純化，亦避免新離子的加入［14］，更適合茅蒼術(shù)葉片蛋白質(zhì)的提取。本研究結(jié)果可為逆境脅迫下茅蒼術(shù)分子機(jī)制在蛋白質(zhì)水平下的變化研究提供基礎(chǔ)資料。

參考文獻(xiàn)：

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：204.

［2］曾 燕，郭蘭萍，陳保冬，等.不同溫度對(duì)茅蒼術(shù)生長(zhǎng)發(fā)育及揮發(fā)油組分的影響［J］.世界科學(xué)技術(shù)（中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2010，12（5）：773－778.

［3］顧永華，馮 煦，夏 冰.水分脅迫對(duì)茅蒼術(shù)根莖生長(zhǎng)及揮發(fā)油含量的影響［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2008，17（3）：23－27.

［4］陳 飛，周 彤，魏宇佳，等.茅蒼術(shù)質(zhì)膜蛋白的制備及其雙向電泳蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)的構(gòu)建［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2016，32（9）：72－82.

［5］谷瑞升，劉群錄，陳雪梅，等.木本植物蛋白提取和SDS－PAGE分析方法的比較和優(yōu)化［J］.植物學(xué)通報(bào)，1999，16（2）：171－177.

［6］華貴煌，董 燕，易 浪，等.魚腥草葉片總蛋白的提取及雙向電泳體系的建立［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)報(bào)，2013，30（3）：375－378.

［7］Xiang F，Xu L，Wang Y，et al.Effective method of leaf protein extraction for proteomic analysis in radish［J］.Molecular Plant Breeding，2012，10（6）：756－760.

［8］陳富成，祁建民，徐建堂，等.圓果種黃麻功能葉總蛋白提取方法及雙向電泳體系的優(yōu)化［J］.作物學(xué)報(bào)，2011，37（2）：369－373.

［9］張 寧，孫曉麗，端木慧子，等.野生大豆葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化研究［J］.大豆科學(xué)，2015，34（5）：874－880.

［10］劉 楠，高 飛，周宜君，等.蒙古沙冬青根蛋白的提取及雙向電泳體系的建立［J］.北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，49（4）：365－368.

［11］丁金鵬，張 娜，李 群.獨(dú)行菜屬植物種子總蛋白4種提取方法的比較［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，54（7）：1305－1312.

［12］沈少炎，吳玉香，榮俊冬，等.兩種花吊絲竹葉片蛋白提取方法的2－DE比較［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，46（1）：50－57.

［13］Alam M，Ghosh W.Optimization of a phenol extraction－based protein preparation method amenable to downstream 2－DE and MALDI－MSbased analysis of bacterial proteomes［J］.Proteomics，2014，14（2／3）：216－221.

［14］高 芳.雪蓮組織中蛋白質(zhì)提取方法比較［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（15）：32－34.