許守濤，劉?，儲(chǔ)衛(wèi)華

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物學(xué)系，江蘇南京210009）

抗生素在疾病防控方面起了積極的作用，但由于抗生素的濫用，導(dǎo)致耐藥細(xì)菌甚至超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，因此尋找抗生素的替代品成為科研人員的關(guān)注熱點(diǎn)。隨著最近幾年對(duì)腸道菌群在疾病發(fā)生過(guò)程中的作用的認(rèn)識(shí)，益生菌作為一種抗疾病的替代品越來(lái)越受到人們的重視，益生菌是一種通過(guò)改善腸道菌群平衡，有益于宿主動(dòng)物的活微生物添加劑［1］。益生菌通過(guò)調(diào)節(jié)黏膜和全身免疫功能以及改善腸道微生物營(yíng)養(yǎng)平衡對(duì)宿主產(chǎn)生有益影響［2－3］。腸道內(nèi)有許多種類(lèi)的微生物，其總數(shù)在1013～1014個(gè)之間，乳酸菌（lactic acid bacterial，LAB）是腸道菌群中的一類(lèi)主要菌群，被認(rèn)為是GRAS（generally recognized as safe）類(lèi)細(xì)菌，可作為有益菌開(kāi)發(fā)的出發(fā)菌株，乳酸菌在促進(jìn)人和動(dòng)物健康，減少抗生素使用等方面越來(lái)越受到重視。乳酸菌具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗應(yīng)激以及抗心血管相關(guān)疾病的作用［4－5］，因此從腸道中分離具有抗菌活性，并能抵抗胃酸、腸液的消化，能到達(dá)腸管的乳酸菌是益生菌開(kāi)發(fā)的前提。本試驗(yàn)旨在從健康成人糞便中分離出生物學(xué)特性優(yōu)良的乳酸菌，從而為其作為益生菌研究、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株分離及表型、生化鑒定

本試驗(yàn)于2016年3月開(kāi)始在中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。取約0.1 g健康成人的糞便樣品至10 mLMRS液體培養(yǎng)基中，將樣品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)⒂眯D(zhuǎn)振蕩器將樣品振蕩均勻；無(wú)菌吸取適宜梯度（10－4、10－5、10－6）的樣品稀釋液 100μL涂布于含 CaCO3的改良MRS固體瓊脂平板上［6］，37℃倒置培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。挑取MRS平板上生長(zhǎng)速度快、具有明顯溶鈣圈的菌落；轉(zhuǎn)移到新的MRS平板，直至純化。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并用乳酸菌生理生化微量發(fā)酵管進(jìn)行生理生化反應(yīng)試驗(yàn)，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行初步鑒定。

1.2 16S rDNA的擴(kuò)增與序列分析

采用細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）提取總DNA。以總DNA為模板，采用通用引物27F和1492R對(duì)CPU9601進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送至南京金斯瑞生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用NCBI上的Blast比對(duì)與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比較，利用MEGA 5.0軟件，鄰位連接法（Neighbor－Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［7］。

1.3 菌株生長(zhǎng)特性的研究

將分離的唾液乳桿菌CPU9601的24 h培養(yǎng)物以1%的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)測(cè)定生長(zhǎng)曲線，并測(cè)定菌液pH值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液吸光度和pH值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線和pH值變化曲線。

1.4 酸、膽鹽耐受試驗(yàn)

將菌株CPU9601接種到MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后；以1%的接種量分別接種于10 mL用1 mol／L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值分別至 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5的 MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)12 h后，測(cè)定600 nm處D值，3次重復(fù)。以1%的接種量分別接種于10 mL含0%、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%質(zhì)量濃度膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，以不加膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，37℃培養(yǎng)12 h后，測(cè)定620 nm處 D值［8］，3次重復(fù)。

1.5 人工模擬胃腸液耐受試驗(yàn)

人工模擬胃腸液需新鮮配制［9］。將胃蛋白酶溶于pH值為2.5的PBS中使其終濃度為3 g／L，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后制備成模擬胃液。將胰蛋白酶溶于pH值為8.0的PBS中使其終濃度為1 g／L，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后制備成模擬腸液。將CPU9601過(guò)夜培養(yǎng)后4℃5 000 r／min離心15 min收集菌體，用無(wú)菌PBS（pH值為7.2）洗滌2次，將菌體重懸于10 mL pH值為2.5的人工胃液中并將其菌液密度調(diào)節(jié)為1×108CFU／mL；混勻后37℃ 200 r／min搖床振蕩培養(yǎng)3 h，分別于0、1、2、3 h計(jì)活菌數(shù)。在模擬胃液中培養(yǎng)3 h后，取1 mL培養(yǎng)液加入至9 mL，pH值為8.0的人工腸液中，混勻后于37℃ 200 r／min搖床振蕩培養(yǎng)6 h；分別于0、2、4、6 h后檢測(cè)活菌數(shù)。用MRS固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。存活率計(jì)算公式：存活率＝N1／N0］。其中N1表示經(jīng)過(guò)模擬胃、腸液處理之后的乳酸菌活菌數(shù)；N0表示未處理前乳酸菌的活菌數(shù)。

表1 菌株CPU9601的生理生化特性

1.6 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用K－B法對(duì)菌株CPU9601進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將CPU9601接種至MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為1%，37℃培養(yǎng)24 h，菌懸液濃度調(diào)整為108CFU／ml并涂布在MRS固體平板表面；之后將標(biāo)準(zhǔn)藥物紙片貼于平板表面，置37℃下培養(yǎng)24 h后測(cè)量并記錄抑菌圈直徑［10］。

1.7 抑菌試驗(yàn)

菌株CPU9601在MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h后；通過(guò)10 000 r／min離心10 min；然后將上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，獲得無(wú)細(xì)胞上清液（cell－free solution，CFS）；采用牛津杯法測(cè)定乳酸菌經(jīng)發(fā)酵得到的無(wú)細(xì)胞上清液的抑菌能力。選用大腸桿菌 ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC32664和銅綠假單胞菌PAO1為指示菌。將上述指示菌菌液吸取50μL均勻涂布于LB培養(yǎng)基固體平板，培養(yǎng)18 h后測(cè)量抑菌圈直徑。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17的單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。將數(shù)據(jù)結(jié)果用Graphpad Prism 5.0繪圖軟件繪制趨勢(shì)圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離及鑒定結(jié)果

從樣本中分離得到40株分離菌，其中5株分離菌株為乳酸菌；可形成鈣溶圈、革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性和無(wú)芽孢形成，在MRS平板上可以生長(zhǎng)良好并形成乳白色的小菌落。根據(jù)抗菌活性篩選結(jié)果，挑取1株抗菌活性較強(qiáng)菌株，命名為CPU9601，進(jìn)行生物學(xué)特性研究。CPU9601經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)后在MRS平板上形成較小圓形凸起菌落，呈乳白色，表面光滑濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊，直徑為（2.0±1）mm（圖1）。該菌株的特征和乳酸菌一致，是一種兼性厭氧菌，其運(yùn)動(dòng)性、過(guò)氧化氫酶活性、明膠液化、淀粉水解、枸櫞酸鹽、硫化氫、吲哚、V－P、葡萄糖產(chǎn)氣、尿素、D－核糖和七葉苷反應(yīng)均為陰性；石蕊牛乳產(chǎn)酸、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和甘露醇反應(yīng)均為陽(yáng)性（表1）。

2.2 菌株CPU9601的16S rDNA擴(kuò)增與序列分析

對(duì)菌株CPU9601進(jìn)行16S rDNA基因PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其長(zhǎng)度約為1 500 bp。經(jīng)測(cè)序得到長(zhǎng)度為1 432 bp的序列，提交至 GenBank，收錄號(hào)為MG017448。對(duì)CPU9601的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該菌株屬于乳桿菌屬，與Lactobacillus salivarius ATCC 11741（AF089108）的序列同源性達(dá)到99%（圖2），結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，將菌株鑒定為唾液乳桿菌。

2.3 菌株CPU9601生長(zhǎng)特性的研究

菌株CPU9601大約在2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，其菌液的pH值也明顯下降，在菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)菌液的酸度迅速降低，在穩(wěn)定期后期 pH值維持在 3.5～4.0（圖3）。

2.4 菌株CPU9601耐酸和膽鹽耐受試驗(yàn)

胃液里含有大量的胃酸，能順利通過(guò)胃液到達(dá)腸道定殖是益生菌的關(guān)鍵特性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在較低的pH值（2.0～30）環(huán)境，CPU9601的生長(zhǎng)被抑制，明顯低于對(duì)照組（pH值為6.5）。膽汁耐受性是菌株在消化道中生長(zhǎng)和生存的重要條件。在這個(gè)試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比（0%），當(dāng)膽汁濃度為2%時(shí)的D620nm值小于1。該菌株能耐受膽汁，但高濃度膽汁可抑制菌株生長(zhǎng)（圖4）。

2.5 菌株CPU9601在人工模擬胃腸液中的生長(zhǎng)測(cè)定

對(duì)菌株CPU9601在人工胃液和人工腸液中的存活試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的增加，菌株CPU9601的活菌數(shù)有所減少，但存活率可保持在85%以上（表2），說(shuō)明唾液乳桿菌CPU9601可在GIT試驗(yàn)條件下存活。

2.6 菌株CPU9601藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)K－B法藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株CPU9601對(duì)于臨床常用抗生素敏感，但對(duì)頭孢他啶、環(huán)丙沙星、苯唑西林、大觀霉素4種抗生素具有抗性，對(duì)呋喃妥因、左氧氟沙星、頭孢吡肟和頭孢曲松中等敏感。

表2 菌株CPU9601在人工胃腸液中的存活率

2.7 菌株CPU9601上清液抑菌試驗(yàn)

菌株CPU9601上清液對(duì)大腸桿菌ATCC25922、鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC32664、金黃色葡萄球菌ATCC25923和銅綠假單胞菌PAO1均具有抑制作用，其抑菌圈直徑分別為（13.45±0.08）、（11.25±0.13）、（12.44±0.44）、（14.23±0.10）mm。

3 討論

隨著人們對(duì)腸道菌群在疾病中作用的不斷認(rèn)識(shí)，通過(guò)益生菌來(lái)改善疾病促進(jìn)健康成為研究重點(diǎn)。目前，益生菌的出發(fā)菌株主要有乳酸菌、芽孢菌以及酵母菌，其中乳酸菌是最為廣泛和認(rèn)可的益生菌。益生菌能否到達(dá)腸道內(nèi)，并在腸道內(nèi)定殖、生長(zhǎng)主要由低酸度環(huán)境和膽汁酸鹽的濃度決定。本研究從健康成人的糞便中分離得到1株具有抗菌活性并能耐酸、耐膽鹽的唾液乳桿菌。菌株CPU9601在pH值為2～3時(shí)其生長(zhǎng)受到抑制，但仍然具有活菌存在；在pH值為4～6.5時(shí)生長(zhǎng)不受限制，保持良好的生長(zhǎng)性能；菌株CPU9601在膽鹽濃度0.1%時(shí)生長(zhǎng)不受影響，但當(dāng)膽鹽濃度達(dá)到0.3%、0.5%、1.0%、2.0%時(shí)，雖然能夠生長(zhǎng)，但菌含量明顯低于對(duì)照組。董曉麗等分離的1株植物乳桿菌GF103也表現(xiàn)為在低pH值的情況下生長(zhǎng)受到抑制，該菌株在0.15%、0.3%的膽鹽濃度下生長(zhǎng)良好［11］。本研究所分離的菌株CPU9601發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌均有一定的抑制作用，這對(duì)感染性疾病的控制將是一個(gè)有效的途徑。乳酸菌的抗菌活性主要是其生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝物，如過(guò)氧化氫、乙酸、乳酸和乳酸菌素都能抑制多種病原體，菌株CPU9601的抑菌功能是何種代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。楊婧等從四川泡菜里分離了10株具有抗菌活性的乳酸菌，經(jīng)過(guò)酸中和后，僅有1株菌對(duì)細(xì)菌和酵母菌仍具有抑菌活性，說(shuō)明該菌株的抗菌活性可能是除乳酸以外的代謝產(chǎn)物［12］。

本研究所分離的CPU9601對(duì)常見(jiàn)的病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和銅綠假單胞菌均具有明顯的抑制作用。通過(guò)生理生化試驗(yàn)和16S rRNA基因序列分析鑒定該菌株屬于唾液乳桿菌。體外評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)該菌株具有較好耐酸、耐膽鹽的特性，能在人工胃液和腸液中存活，說(shuō)明其能適應(yīng)動(dòng)物胃和腸道內(nèi)環(huán)境。如何確定其生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用效果，還有待進(jìn)一步的研究及生產(chǎn)檢驗(yàn)。

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