王景然，王 萌，汪 洋，呂 爽，付 爽，劉 佳，吳松權(quán)

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002）

黃芪是傳統(tǒng)的補(bǔ)益類中草藥，是多年生草本藥用植物，分為膜莢黃芪和蒙古黃芪2個(gè)變種［1］。黃芪主產(chǎn)于我國北方地區(qū)，如東北、華北、西北和內(nèi)蒙古。膜莢黃芪別稱東北黃芪，是長白山的道地藥材之一，是重點(diǎn)保護(hù)的珍惜藥用植物。黃芪中富含黃酮類、黃芪皂苷、多糖類等［2］多種化學(xué)成分，其化學(xué)成分決定藥用價(jià)值?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪具有提高機(jī)體免疫力、強(qiáng)心降壓、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理功效，能促進(jìn)免疫器官功能和抗體生成［3］。黃芪不僅用于臨床治療，在保健、食品、化妝品等領(lǐng)域也得到廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)今，市場對黃芪的需求主要運(yùn)用在生產(chǎn)各類黃芪制劑和以黃芪為原料的保健品等方面，由于以黃芪為主的新藥研發(fā)不斷取得突破，導(dǎo)致野生資源遭到嚴(yán)重破壞［4］，只能通過人工栽培滿足市場需求，而人工栽培黃芪技術(shù)又不完善，存在明顯的缺陷，人工栽培的黃芪與野生黃芪在主要活性成分含量上存在一定的差距［5］。因此，如何提高黃芪活性成分的積累將在黃芪生產(chǎn)過程中有著十分重要的意義［6］。

水楊酸（salicylicacid，SA）是一種廣泛分布于高等植物體內(nèi)的小分子酚類物質(zhì)［7］，被認(rèn)為是一種內(nèi)源信號分子，對植物種子萌發(fā)、成花誘導(dǎo)、呼吸代謝、抗性及衰老等生理過程有重要調(diào)節(jié)作用。水楊酸可以通過改變多種細(xì)胞代謝和調(diào)節(jié)防御機(jī)制來響應(yīng)各種生物和非生物脅迫，從而增強(qiáng)植物的抗逆性［8］。最近幾年，已經(jīng)有大量的關(guān)于外源水楊酸在果樹、蔬菜、作物、草坪等方面抵御非生物脅迫的相關(guān)報(bào)道［7－8］。通過研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)逆境脅迫，提高POD、SOD等抗氧化酶的活性來保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膜通透性和降低MAD的含量，從而提高植物對干旱、高溫、高鹽等逆境脅迫的抗性。同時(shí)水楊酸處理可以提高植物植保素及其相關(guān)合成酶類、蛋白含量和各種防御機(jī)制，促進(jìn)植物代謝產(chǎn)物的生成，從而提高植株的抗病性。適宜濃度的水楊酸處理促進(jìn)植株根與葉的生長，調(diào)節(jié)植株的光周期和植株葉片氣孔，從而提高植物的光合速率和光合產(chǎn)物的積累［9］。

目前，關(guān)于黃芪的研究主要集中于主要化學(xué)成分的提取和藥理活性方面。由于植物的化學(xué)成分生物合成的復(fù)雜性，促使人們通過不同的手段誘導(dǎo)化學(xué)成分的積累。通過誘導(dǎo)子對目標(biāo)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑進(jìn)行調(diào)控，被認(rèn)為是能夠提高植物化學(xué)成分含量的重要方法之一［10］。水楊酸作為誘導(dǎo)子之一，有利于化學(xué)成分的積累。如Tewari等研究表明，水楊酸能夠誘導(dǎo)一氧化氮和ROS生成，刺激人參根中人參皂苷的積累［11］。而水楊酸應(yīng)用于黃芪的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究水楊酸對膜莢黃芪幼苗生長過程中總黃酮和多糖化學(xué)成分積累的影響，為提高膜莢黃芪活性成分的含量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

長白山野生膜莢黃芪種子；蕓香苷對照品，購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；DPPH，購于Solarbio公司；紫外可見分光光度計(jì)，購于屹譜儀器制造（上海）有限公司；其他試劑均為分析純，購于國內(nèi)公司。

1.2 膜莢黃芪幼苗的培養(yǎng)與處理

2016年10月11日在實(shí)驗(yàn)室參照Wu等的方法［12］，先用流水沖洗黃芪種子3 h，75%乙醇溶液浸泡1 min，無菌水沖洗3次，再用0.1%HgCl2消毒2 min，無菌水沖洗3次，將處理的膜莢黃芪種子平鋪于培養(yǎng)皿上，置于溫度為26℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。10月16日待到種子生根發(fā)芽長出子葉時(shí)，轉(zhuǎn)到光照為2 500 lx、光／暗為16 h／8 h、溫度為25℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。11月11日選取生長旺盛、生長勢一致和伸出真葉的黃芪幼苗作為試驗(yàn)材料進(jìn)行水楊酸噴施處理，水楊酸濃度分別為 100、200、400μmol／L，分別培養(yǎng) 1、3、7 d收集幼苗，以噴施清水作為對照組，共12個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。在水楊酸噴施處理前先收集部分黃芪幼苗作為原始對照。

1.3 黃芪生物量的測定

從每個(gè)處理中選取生長勢一致的3株黃芪幼苗在60℃下烘干至恒質(zhì)量，測量其干物質(zhì)的質(zhì)量，取平均數(shù)即為生物量，其他樣品烘干后用于測定總黃酮和多糖含量，所有樣品都設(shè)置3次重復(fù)。

1.4 黃芪總黃酮的提取與含量測定

1.4.1 黃芪總黃酮的提?。?3］稱取 0.1 g烘干至恒質(zhì)量的樣品，加入液氮充分研磨，加入2 mL無水乙醇，175 r／min振蕩萃取 24 h，超聲處理20 min，12 000 r／min離心15 min，收集上清液用無水乙醇定容至2 mL，即為樣品溶液。

1.4.2 黃芪總黃酮含量的測定 采用硝酸鋁比色法［14］測定，具體的方法參照秦嘉澤等的方法［4］：準(zhǔn)確稱取1 mg蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，用30%乙醇溶液溶解定容到容量瓶中，混合均勻配置成標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取對照品溶液0、0.4、0.8、12、1.6、2.0 mL置于容量瓶中，用 30%乙醇加至 5 mL，分別加入0.3 mL 5%亞硝酸鋁溶液，混合靜置7 min，加入0.3 mL 10%的硝酸鋁溶液，混合靜置7 min，加入2.0 mL 1 mol／L的氫氧化鈉溶液，并用30%乙醇定容至10 mL，靜置16 min，測定其在510 nm波長處的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 y＝11.789 9x＋0.066 7，r2＝0.997 8。

取0.5 mL樣品溶液，空白對照組為取樣0 mL，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法中的“用30%乙醇加至5 mL”起，至“測定樣品溶液的吸光度”，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品溶液總黃酮的濃度。

1.5 黃芪多糖的提取與含量測定

1.5.1 黃芪多糖的提取 采用微波提取法［15］提取膜莢黃芪苗中的多糖：準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品，加入3 mL的蒸餾水。調(diào)節(jié)超聲波功率為65W，溫度65℃，超聲30 min，靜置10 min，抽取上清液加入2倍體積的無水乙醇，離心得到的沉淀即為黃芪多糖，用蒸餾水溶解得到的即為多糖樣品溶液。

1.5.2 黃芪多糖含量的測定 采用苯酚－硫酸比色法測定膜莢黃芪多糖含量，具體的方法參照陳玉霞等的方法［14］：準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用蒸餾水溶解定容至100 mL，制成葡萄糖濃度為0.1 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取對照品溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于容量瓶中，分別加入1 mL的5%苯酚溶液，搖勻后再加入5 mL的濃硫酸，在沸水中加熱15 min，取出迅速放入冷水中30 min。取出后測定在490 nm波長處的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 y＝0.243 2x－0.007 54，r2＝0.995 4。

取0.5 mL樣品溶液，空白對照組為取樣0 mL，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法中的“加入1 mL的5%苯酚溶液”起至“測定樣品溶液的吸光度”，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品溶液多糖的含量。

1.6 黃芪抗氧化活性的測定

參照Kilani等的方法［16］測定膜莢黃芪抗氧化活性。準(zhǔn)確抽取樣品溶液0.5 mL，加入1 mL 200μmol／L DPPH溶液，在室溫下暗反應(yīng)35 min，在517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率 A＝［1－－）］100%［16］；式中：D［17］i為DPPH與樣品溶液混合液的吸光度；為無水乙醇與樣品溶液混合液的吸光度為無水乙醇與DPPH混合液的吸光度。

1.7 分析數(shù)據(jù)

利用SPSS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長時(shí)期黃芪苗生物量

由圖1可見，膜莢黃芪苗在培養(yǎng)前期與對照組相比無明顯差異，而在培養(yǎng)3、7 d時(shí)隨水楊酸濃度的增加，觀察到黃芪苗生物量逐漸下降。當(dāng)水楊酸濃度為200、400μmol／L時(shí)，觀察到黃芪生物量顯著下降，并隨水楊酸濃度增加下降越明顯；而當(dāng)水楊酸濃度為100μmol／L時(shí)，與對照組相比無明顯差異，下降幅度小。這與觀察到的黃芪幼苗生長的表型相吻合。隨著培養(yǎng)時(shí)間和水楊酸濃度的增加，黃芪幼苗逐漸表現(xiàn)出生長力減弱、葉片萎蔫的現(xiàn)象。在培養(yǎng)7 d后，黃芪植株葉片黃化甚至出現(xiàn)死亡。

2.2 水楊酸濃度對黃芪苗總黃酮含量的影響

由圖2可知，不同水楊酸濃度對黃芪苗總黃酮的積累產(chǎn)生重要的影響。膜莢黃芪苗在培養(yǎng)1 d時(shí)總黃酮含量與對照組出現(xiàn)明顯差異，在低濃度水楊酸（100、200μmol／L）下總黃酮顯著增加，在高濃度水楊酸（400μmol／L）下總黃酮量又顯著高于低濃度下的總黃酮量。但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，400μmol／L水楊酸處理的試驗(yàn)組總黃酮量增加的速度明顯減慢，基本保持不變，無明顯差異；而低濃度水楊酸處理的試驗(yàn)組總黃酮量仍明顯的提高。對比100μmol／L水楊酸與200μmol／L水楊酸的試驗(yàn)組，培養(yǎng)天數(shù)為 3、7 d時(shí)，200μmol／L水楊酸的試驗(yàn)組黃芪苗總黃酮增加量顯著高于100μmol／L水楊酸的試驗(yàn)組，而100μmol／L水楊酸的試驗(yàn)組總黃酮的含量無明顯差異，在培養(yǎng)7 d后達(dá)到最大值（85.13μg／g）。雖然400μmol／L水楊酸處理的試驗(yàn)組總黃酮量高于100μmol／L水楊酸與200μmol／L水楊酸的試驗(yàn)組，但是400μmol／L水楊酸處理的黃芪苗生長勢弱且出現(xiàn)死亡的植株，不利于植株的生長。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，不同濃度水楊酸處理后黃芪苗中總黃酮的積累量逐漸增加，均明顯高于對照組，表明水楊酸對黃芪苗總黃酮的積累具有促進(jìn)作用。這與杜研等的研究中低濃度水楊酸能夠提高黃芪愈傷組織中總黃酮含量的結(jié)果［10］相同。黃芪在400μmol／L水楊酸濃度下產(chǎn)生了激素脅迫，對植物細(xì)胞具有毒害作用［10］。雖然高濃度水楊酸（400μmol／L）促進(jìn)總黃酮積累量的增加，但是植株死亡的現(xiàn)象更加嚴(yán)重，與對照組相比，植株的生物量明顯下降。

2.3 水楊酸濃度對黃芪苗多糖含量的影響

由圖3可知，培養(yǎng)1 d時(shí)，與對照相比，黃芪植株多糖含量明顯提高，但試驗(yàn)組之間多糖含量基本相同，差異不顯著，原因可能是由于培養(yǎng)天數(shù)過短，水楊酸未對植株產(chǎn)生明顯的刺激作用；培養(yǎng)3、7 d時(shí)，隨著水楊酸濃度的增加，黃芪幼苗中多糖的積累有1個(gè)波峰。在100、200μmol／L水楊酸濃度下觀察到多糖含量明顯提高，在200μmol／L水楊酸濃度下培養(yǎng)7 d達(dá)到最大值（8.12 mg／g）；在 400μmol／L水楊酸濃度下多糖的含量急劇下降，僅僅大于對照組。結(jié)果說明，多糖的積累與水楊酸濃度和培養(yǎng)時(shí)間緊密相關(guān)，低濃度的水楊酸（100、200μmol／L）促進(jìn)黃芪幼苗多糖的積累，而高濃度的水楊酸（400μmol／L）對植株形成激素脅迫，植株的生長和組織結(jié)構(gòu)受到破壞，促使植株新陳代謝減慢甚至停止，而原有積累的多糖逐漸降解和破壞［9］，以抵抗外界環(huán)境的改變。

2.4 水楊酸濃度對黃芪苗抗氧化活性的影響

總黃酮最重要的特性為抗氧化活性，因此通過測定DPPH自由基清除率確定黃芪苗生長過程中的抗氧化活性。由圖4可知，DPPH自由基清除率表示了黃芪幼苗不同生長時(shí)期的抗氧化活性。自由基清除率隨著培養(yǎng)天數(shù)和水楊酸濃度增加呈現(xiàn)上升的趨勢，與黃芪幼苗總黃酮含量成正相關(guān)。在培養(yǎng)7 d后，對照組與試驗(yàn)組清除自由基能力達(dá)到最大值，且400μmol／L水楊酸處理的試驗(yàn)組清除自由基的能力最強(qiáng)，明顯高于其他試驗(yàn)組。雖然400μmol／L水楊酸處理試驗(yàn)組的植株生長勢最差，甚至出現(xiàn)死亡的植株，有可能是因?yàn)楦邼舛人畻钏岢鲋仓甑某惺苣芰?，形成激素脅迫，抑制黃芪幼苗的生長，但是黃芪幼苗為抵制水楊酸逆境脅迫，提高植株植保素及其相關(guān)合成酶類、蛋白含量和各種防御機(jī)制，從而提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量，促進(jìn)植株體內(nèi)總黃酮和多糖等次生代謝產(chǎn)物的積累，出現(xiàn)了400μmol／L水楊酸處理的試驗(yàn)組清除自由基能力最強(qiáng)的現(xiàn)象［7］。

3 結(jié)論

水楊酸有效地誘導(dǎo)了膜莢黃芪活性成分的積累，在低濃度水楊酸（100、200μmol／L）能夠有效促進(jìn)總黃酮和多糖的積累，從而進(jìn)一步提高自由基清除率，但是高濃度水楊酸（400μmol／L）不利于多糖和黃芪生物量的積累，高濃度水楊酸對植株形成激素脅迫，抑制植株的生長。

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