吳 ，李慧敏，楊 維，楊錦紅，陳 敏，李進昆，蹇洪英

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，云南昆明650205）

薔薇屬（Rosa L.）的分類系統(tǒng)非常復(fù)雜，這種復(fù)雜性是由演化過程如雜交、基因漸滲等導(dǎo)致的表型、基因型和生態(tài)型的變異和可塑性所共同產(chǎn)生的［1］，這些因素之間又相互關(guān)聯(lián)［2］。薔薇屬植物的表型可塑性給其分類帶來了很大的麻煩，不同的分類系統(tǒng)對物種數(shù)的認(rèn)定也各不相同，其種下分類更是復(fù)雜。

東喜馬拉雅－橫斷山地區(qū)是薔薇屬植物的分布中心之一，橫斷山地區(qū)分布有薔薇屬植物45個種、18個變種和10個變型［3－4］。川滇薔薇（R.soulieana Crép）是橫斷山地區(qū)的薔薇屬代表植物之一，廣泛分布在海拔2 500～3 700 m的灌叢、山坡、溪邊及農(nóng)地旁，蘊藏著對月季品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新所需的耐干旱［5］、耐貧瘠和花香等重要的優(yōu)異性狀及相關(guān)基因，是一種非常重要的月季種質(zhì)資源［6］。根據(jù)花序中小花數(shù)量、葉片大小及有無毛和有無腺等特征分為川滇薔薇原變種（R.soulieana var.soulieana）、毛葉川滇薔薇（R.soulieana var.yunnanensis）、大葉川滇薔薇（R.soulieana var.sungpanensis）和小葉川滇薔薇（R.soulieana var.microphylla），小葉川滇薔薇和大葉川滇薔薇分別只在西藏八宿和四川松藩有分布，毛葉川滇薔薇主要分布在云南，原變種則在橫斷山地區(qū)廣泛分布［7－8］。《中國植物志》和《Flora of China》均認(rèn)為安徽省金寨縣也有川滇薔薇原變種分布。實際上，在野外調(diào)查和標(biāo)本查閱中可以發(fā)現(xiàn)川滇薔薇各變種之間的分類特征界限并不明顯，過渡類型較多。那么，現(xiàn)有的種下分類系統(tǒng)是否真實地反映了川滇薔薇種內(nèi)的遺傳變異？來自安徽的川滇薔薇居群與來自橫斷山地區(qū)的川滇薔薇居群之間的相互關(guān)系如何？川滇薔薇種內(nèi)的表型變異究竟如何？為了弄清這3個問題，有必要對來自橫斷山地區(qū)的川滇薔薇居群以及來自安徽金寨的川滇薔薇居群進行種下分類系統(tǒng)和表型變異研究。

形態(tài)標(biāo)記是檢測遺傳多樣性大小和分布的傳統(tǒng)標(biāo)記，形態(tài)特征多樣性常被用來估計居群間或居群內(nèi)的遺傳變異［9］。單拷貝核基因遵循雙親遺傳方式，能提供大量信息位點，且能減少旁系同源（paralog）的影響［10］。本研究利用2個單拷貝核基因片段：3－磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）、葉綠體表達的谷氨酰胺合成酶基因（chloroplast－expressed glutamine synthetase，ncpGS）以及43個形態(tài)特征對川滇薔薇來自橫斷山地區(qū)的38個居群和來自安徽金寨的1個居群進行聚類分析，探討川滇薔薇的種下分類系統(tǒng)，同時研究其表型多樣性及表型變異特征。

1 材料與方法

1.1 研究材料

根據(jù)標(biāo)本記錄，在有標(biāo)本和分布記錄的橫斷山地區(qū)以及安徽省金寨縣進行川滇薔薇的標(biāo)本和分子材料采集。采樣策略遵循居群生態(tài)學(xué)采樣的原理和方法［11］，同時用GPS記錄居群的詳細(xì)信息，如經(jīng)度、緯度和海拔（表1）。

1.2 研究方法

1.2.1 基于單拷貝核基因片段的居群間系統(tǒng)關(guān)系 （1）總DNA提取和PCR擴增。每個居群隨機選擇1個個體，用植物總DNA提取試劑盒（Plant DNA－Easy kit，北京百泰克公司）進行所有樣品［包括麗江薔薇（R.lichiangensis Yüet Ku）和野薔薇（R.multiflora Thunb）2個外類群］總DNA的提取。選擇GAPDH和ncpGS這2個單拷貝核基因作為目的片段。GAPDH的引物序列為：GPDX7－F，5′－GATAGATTTGGAATT GTTGAGG－3′；GPDX11－R，5′－GACATTGAATGAGATAAA CC－3，PCR反應(yīng)程序參照 Joly等的方法［12］。ncpGS的引物序列為：GScp687－F，5′－GATGCTCACTACAAGGCTTG－3′；GScp994－R，5′－AATGTGCTCTTTGTGGCGAAG－3′［13］，PCR反應(yīng)程序參照Meng等的方法［14］。用2%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產(chǎn)物的質(zhì)量和濃度，最終產(chǎn)物送上海美吉生物技術(shù)公司進行序列測定。

（2）數(shù)據(jù)分析。采用Chromas軟件對測序結(jié)果進行核對，核對后的單條序列用 DNAStar（gene codes corporation，USA）進行序列拼接，對于測序結(jié)果中存在的雜合位點用簡并堿基進行代替。從 GeneBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genebank）下載光葉薔薇（R.luciae Franch.et.Roch.）和懸鉤子薔薇（R.rubus Lével.）的相應(yīng)序列。采用 Clustal ver.181［15］對所有序列進行比對，用 BioEdit ver.7.0.4.1軟件［16］進行修正。采用 Mega 6.0軟件［17］分別構(gòu)建基于最大似然法的ML樹和最大簡約法的50%一致樹。

1.2.2 基于形態(tài)數(shù)據(jù)的居群間聚類關(guān)系 形態(tài)數(shù)據(jù)的編碼及測量：根據(jù)《中國植物志》對薔薇主要是川滇薔薇及其變種的分類特征的描述，選取與枝、刺、葉和花等形態(tài)相關(guān)的43個表型性狀進行編碼，共包含14個二元性狀、2個多元性狀和27個直接數(shù)量性狀。對含安徽金寨居群在內(nèi)的花和葉形態(tài)特征較完善的31個居群的所有個體進行形態(tài)特征測量，測定值或計數(shù)值即為編碼（表2）。每個個體每個數(shù)量性狀重復(fù)3次，與葉相關(guān)的性狀以花枝上中間部位的復(fù)葉為測量對象；與花相關(guān)的性狀則以完全展開的花朵為測量對象。用游標(biāo)卡尺測定花梗長、萼筒的長與寬，并計算萼筒的長寬比。

表1 川滇薔薇居群信息

表2 表型性狀及編碼

形態(tài)數(shù)據(jù)分析方法：采用NTSYS pc ver.2.1對形態(tài)數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化，然后進行居群的PCA分析和居群間基于表型的UPGMA聚類。

1.2.3 表型多樣性和居群間表型變異的研究方法 形態(tài)數(shù)據(jù)的測量方法見“1.2.2”節(jié)，主要用27個數(shù)量性狀對根據(jù)單拷貝核基因和表型聚類結(jié)果已確定為川滇薔薇的來自橫斷山的30個居群的所有個體進行測量。采用SPSS13.0軟件進行居群各數(shù)量性狀的均值（Mean）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）的統(tǒng)計，用SAS 9.0軟件進行各直接數(shù)量性狀在居群間和居群內(nèi)的方差分析。其中，表型分化系數(shù)的計算同楊維澤等的方法［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于GAPDH和ncpGS居群間親緣關(guān)系

2.1.1 序列特征 比對后ncpGS基因數(shù)據(jù)矩陣長700 bp，有

21個變異位點，其中13個是信息位點。比對后的GAPDH基因數(shù)據(jù)矩陣長719 bp，有57個變異位點，其中28個是信息位點。2個片斷聯(lián)合后形成的數(shù)據(jù)矩陣長1 419 bp，有78個變異位點，其中41個是信息位點。

2.1.2 居群間系統(tǒng)關(guān)系 從圖1可以看出，來自橫斷山的所有川滇薔薇居群總是單獨地成為一支，在ML樹中與來自安徽（AH）的材料和懸鉤子薔薇一起成為并系，說明來自安徽的材料可能不屬于川滇薔薇。50%MP一致樹也表明，來自橫斷山的川滇薔薇居群單獨成為一支，而來自安徽的材料則以50%的靴帶值（bootstrap值）與來自合柱組的其他種單獨構(gòu)成一支。因此，來自安徽的材料不是川滇薔薇。在川滇薔薇內(nèi)，來自橫斷山的居群并沒有嚴(yán)格地按照地理距離或種下分類系統(tǒng)的4個變種進行聚類。如根據(jù)形態(tài)特征被定名為大葉川滇薔薇的松藩居群（SP）在ML樹和50%MP一致樹中都與被定名為川滇薔薇原變種的丹巴（DB）、黑水（HS）、金川（JC）和馬爾康（MEK）等居群聚在一起；被定名為原變種的小金（XJ）和理縣（LX）等居群又與被定名為毛葉變種的寧蒗（NL）、德欽云嶺（DQyl）等居群聚在一起。

2.2 基于表型性狀的居群間相互關(guān)系

2.2.1 不同居群基于表型性狀的主成分分析 對含安徽居群在內(nèi)的39個居群的主成分分析，結(jié)果（表3）表明，對第一主成分貢獻最大的是頂端小葉長（TLL）、中部小葉長（MLL）、葉片連柄長（LLPP）、頂端小葉柄長（TLSL）、基部小葉長（BSL）、葉柄長（PTL）、中部小葉寬（MLW）、頂端小葉寬（TLW）、基部小葉寬（BSW）以及花序的小花數(shù)（FNPI）。對第二主成分貢獻最大的是花直徑（FLD）、花瓣寬（PTAW）、花瓣長（PTAL）和萼片寬（SPLW）。對第三主成分貢獻最大的是苞片長（BRL）、苞片寬（BRW）、柱頭長（STL）以及柱頭數(shù)量（STN）。第一主成分的貢獻率為33.26%，第二和第三主成分的貢獻率分別為18.15%和10.82%，前3個主成分的累計貢獻率為62%，說明可以應(yīng)用主成分分析法進行39個居群的表型聚類分析。從圖2可以看出，AH居群與來自橫斷山地區(qū)的川滇薔薇居群形態(tài)差異較大。AH居群的頂端小葉葉柄長可達1.06 cm，花梗長1.64 cm，均遠(yuǎn)大于來自橫斷山的川滇薔薇居群。雖然其葉片、頂端小葉葉柄長及花梗長等均較大，但其花部特征偏小，主要是花的直徑?。?.26 cm）、花瓣窄（1.17 cm）、花柱短（0.381 cm）、萼筒近圓形。來自橫斷山地區(qū)的麗江文海（LJwh）、麗江新主（LJxz）、察隅古玉（CYgy）、寧蒗（NL）、鹽源（YY）、康定（KD）、中甸（ZD）和松藩（SP）等居群間關(guān)系較松散，而其他居群之間的表型差異較小、親緣關(guān)系較近。

2.2.2 不同居群基于表型性狀的UPGMA聚類 各居群基于歐氏距離（EUCLID）的聚類結(jié)果（圖3）表明，安徽（AH）群體離其他居群的遺傳距離最遠(yuǎn)，而分布于橫斷山地區(qū)的其他居群并未嚴(yán)格按地理距離進行聚類。雖然部分居群間由于地理距離近且表型相近而聚為一支，但不是所有地理距離相近的居群聚在一起，另有其他與之距離很遠(yuǎn)的居群與之聚在一起，如鹽源、寧蒗和麗江新主居群形成了一個小分支，與來自康定的居群聚為一支；來自松藩和察隅的居群聚為一支；這2支最后又與來自麗江文海的居群聚為一大支，與來自藏東南和川西的其他居群所構(gòu)成的另一大支并列。來自藏東南和川西的其他居群所構(gòu)成的另一大支也同樣存在類似的情況。由此可見，基于表型性狀的居群間也沒有根據(jù)種下變種進行聚類。

2.3 川滇薔薇居群的表型多樣性及表型分化

2.3.1 川滇薔薇表型性狀的變異特征 川滇薔薇27個直接數(shù)量性狀在居群間的差異均達到極顯著水平（P＜0.01，表4）。與葉相關(guān)的性狀在居群內(nèi)的差異均達到了極顯著水平（P＜0.01），而除花序小花數(shù)（FNPI）外，與花相關(guān)的性狀在居群內(nèi)的差異均不顯著（P＞0.05）?；ㄐ蛐』〝?shù)和皮刺數(shù)量（THN）在居群內(nèi)的變異最大，30個居群的平均變異系數(shù)分別為59.8%和45.29%，萼片寬（SPW）和葉片小葉數(shù)（LLN）在居群內(nèi)最穩(wěn)定，30個居群的平均變異系數(shù)分別為11.79%和12.58%。

2.3.2 川滇薔薇群體間的表型分化 川滇薔薇27個數(shù)量性狀的平均表型分化系數(shù)為66.36%，說明居群間的表型變異是川滇薔薇表型變異的主要來源。刺數(shù)量、近花序葉片小葉數(shù)、萼片長度的表型分化系數(shù)小于50%，表明這些性狀的遺傳變異主要來自于居群內(nèi)，而其他性狀的遺傳變異則主要來源于居群間（表5）。

3 討論與結(jié)論

3.1 川滇薔薇是橫斷山地區(qū)的特有種，安徽沒有川滇薔薇分布

《中國植物志》和《Flora of China》都認(rèn)可安徽有川滇薔薇的分布［7－8］，但王春景等通過對有關(guān)資料記錄和標(biāo)本的查看，實地調(diào)查走訪卻并未采到實物［19］。本研究所采用的安徽居群采自北京植物所標(biāo)本管（PE）的川滇薔薇標(biāo)本記錄地點?；?個單拷貝核基因的居群間系統(tǒng)關(guān)系表明，來自安徽的材料與其他38個來自橫斷山地區(qū)的川滇薔薇居群的遺傳距離較遠(yuǎn)。雖然支持率不高，但ML樹、50%的MP嚴(yán)格一致樹均顯示其不屬于川滇薔薇，與川滇薔薇、懸鉤子薔薇、野薔薇和麗江薔薇成為并系。在基于表型性狀的聚類分析和主成分分析中，來自安徽的材料與其他來自橫斷山地區(qū)的川滇薔薇相距很遠(yuǎn)。此外，由于有報道的安徽省內(nèi)分布的薔薇屬合柱組全緣托葉系只有川滇薔薇、軟條七薔薇、瑯琊薔薇（R.langyashanica）和懸鉤子薔薇［19］，其中瑯琊薔薇的葉片邊緣有較深的尖銳鋸齒，軟條七薔薇的小葉多為3～5個，且較大、容易識別，懸鉤子薔薇與川滇薔薇從現(xiàn)有的檢索表中進行檢索時常因葉背有無毛等容易誤判。因此，川滇薔薇是橫斷山地區(qū)的特有種，安徽沒有川滇薔薇分布，以前被認(rèn)為是川滇薔薇的來自安徽的標(biāo)本可能是懸鉤子薔薇。

表3 表型性狀主成分分析中前3位主成分的特征根和特征向量

3.2 川滇薔薇基于單拷貝核基因和形態(tài)特征的種下分類系統(tǒng)

Stebbins指出，“植物分類引用了亞種、變種、變型等種下單位，這種分類方法所造成的混亂多于它所要澄清的混亂”［20］。其中，變種是指具有形態(tài)生理、遺傳特征差異但在地理分布上可能重疊的群體，有時也指未弄清地理分布的亞種。

隨著進化植物學(xué)的發(fā)展，種下分類越來越比較客觀地反映出植物各類群間的親緣關(guān)系，尤其是種下分類單位，從居群遺傳和變異的角度闡釋得更加清楚［21］。根據(jù)居群間基于核基因和形態(tài)特征的聚類分析以及形態(tài)特征的PCA分析可知，根據(jù)葉片等表型性狀來進行的川滇薔薇種下分類系統(tǒng)并不能反映其種內(nèi)的遺傳變異。表型聚類除來自安徽的材料外，其他30個居群直接聚類成兩大支。第一大支與第二大支的主要區(qū)別在于花序上的花朵數(shù)和小葉片大小。第一大支的花朵數(shù)都在10朵以上，葉片中部和頂端小葉片長于2 cm，然而居群間基于核基因的聚類既沒有反映形態(tài)變異，也沒有按照地理距離進行。這可能是由于川滇薔薇主要分布在橫斷山地區(qū)的干暖河谷及其支流河岸，有時也延伸到海拔3 700 m以下的山坡路邊和灌叢中。雖然河流和峽谷有利于川滇薔薇同一流域的居群間基因交流和遷移，但分布于同一流域不同緯度、不同海拔即使具有相同或相近的遺傳背景（基因型）的居群及個體，也會由于對環(huán)境的適應(yīng)而形成許多不同的形態(tài)特征。

表4 川滇薔薇各居群表型性狀的變異系數(shù)

續(xù)表4

表5 川滇薔薇直接表型數(shù)量性狀的方差分量及群體間分化系數(shù)

3.3 川滇薔薇的表型多樣性和表型分化

表型差異可能并不與潛在的基因突變數(shù)目成比例。性狀的表達主要取決于性狀本身，取決于是單基因或是多基因控制。此外，對薔薇屬植物來說，其發(fā)育階段、對環(huán)境的可塑性程度等對表型差異的影響并非一成不變［22］。唐開學(xué)等分別對川滇薔薇、峨眉薔薇（R.omeiensis Rolfe）、大花香水月季［R.odorata（Andr.）Sweet var.gigantea（Crép.）Rehd.etWils.］和中甸刺玫（R.praelucens Byhouwer）等分布于云南的居群進行基于表型性狀的多樣性研究，結(jié)果顯示，它們的表型在居群間和居群內(nèi)均存在豐富的變異，但不同物種的表型變異與地理距離之間的關(guān)系不同。其中，川滇薔薇在云南省內(nèi)幾個居群的表型多態(tài)性豐富，變異主要來源于居群間［23－26］。本研究中，川滇薔薇整個分布區(qū)30個居群的27個表型性狀觀測值差異均達到極顯著水平，變異系數(shù)變幅為 11.79% ～5980%。川滇薔薇存在豐富的表型多樣性，表型分化系數(shù)為66.36%，說明居群間的表型變異是川滇薔薇表型變異的主要來源，再次表明在橫斷山地區(qū)因其特殊的環(huán)境特點，廣泛分布的川滇薔薇表型在種內(nèi)分化劇烈，居群間存在顯著的表型變異。這種變異是否是其遺傳變異的完全體現(xiàn)，尚待進一步通過分子水平的遺傳多樣性進行研究驗證。

參考文獻：

［1］Cock K D.Genetic diversity ofwild roses（Rosa spp.）in Europe，with an in depth morphological study of Flemish populations［D］.Ghent：Ghent University，2008.

［2］Wissemann V.Evolution by hybridisation.The influence of reticulate evolution of biosymmetrical patterns and processes in plants［J］.Theory in Biosciences，2005，123（3）：223－233.

［3］中國科學(xué)院青藏高原綜合科學(xué)考察隊.橫斷山區(qū)維管植物（下冊）［M］.北京：科學(xué)出版社，1994.

［4］Jian H Y，Li SF，Li SB，et al.Diversified and valuable wild roses in the Hengduan Mountains， Southwestern China［J］. Acta Horticulturae，2015（1064）：39－45.

［5］周志瓊，包維楷，吳福忠，等.岷江干旱河谷黃薔薇和川滇薔薇更新能力及其限制因素［J］.生態(tài)學(xué)報，2009，29（4）：1931－1939.

［6］蹇洪英.川滇薔薇的遺傳分化及地理分布格局形成研究［D］.昆明：中國科學(xué)院大學(xué)，2015.

［7］谷粹芝.中國薔薇科植物分類之研究（六）［J］.植物研究，1990，10（1）：1－15.

［8］Ku T C，Robertson K R.Rosa（rosaceae）［M］.Louis：Missouri Botanical Garden Press，2003：339－381.

［9］Ayele T B，Gailing O，F(xiàn)inkeldey R.Assessment and integration of genetic，morphological and demographic variation in Hagenia abyssinica（Bruce）J.F.Gmel to guide its conservation［J］.Journal for Nature Conservation，2011，19（1）：8－17.

［10］Duarte JM，Wall P K，Edger P P，et al.Identification of shared single copy nucear genes in Arabidopsis，Populus，Vitis and Oryza and their phylogenetic utility across various taxonomic levels［J］.BMC Evolutionary Biology，2010，10（1）：61－78.

［11］錢迎倩，馬克平.生物多樣性研究的原理和方法［M］.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

［12］Joly S，Starr JR，LewisW H，etal.Polyploid and hybrid evolution in roses eastof the Rocky Mountains［J］.American Journal of Botany，2006，93（3）：412－425.

［13］Emshwiller E，Doyle J J. Chloroplast－ expressed glutamine synthetase（ncpGS）：potential utility for phylogenetic studieswith an example from Oxalis（Oxalidaceae）［J］.Molecular Phylogenetics and Evolution，1999，12（3）：310－319.

［14］Meng J，F(xiàn)ougere－Danezan M，Zhang L B，et al.Untangling the hybrid origin of the Chinese tea roses：evidence from DNA sequences of single－copy nuclear and chloroplastgenes［J］.Plant Systematics and Evolution，2011，297（3／4）：157－170.

［15］Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The CLUSTAL＿X windows interface：flexible strategies formultiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］.Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876－4882.

［16］Hall T A.BioEdit：a user friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95／98／NT［J］.Nucleic Acids Symposium Series，1999，41：95－98.

［17］Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al.MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725－2729.

［18］楊維澤，金 航，楊美權(quán)，等.云南滇龍膽居群表型多樣性及其與環(huán)境關(guān)系研究［J］.西北植物學(xué)報，2011，31（7）：1326－1334.

［19］王春景，周守標(biāo)，黃文江，等.安徽薔薇屬植物資源及其開發(fā)利用［J］.中國野生植物資源，2005，24（1）：32－35.

［20］Stebbins G L.Variation and evolution in plants［M］.New York：Columbia University Press，1970.

［21］沈顯生，張錫亭.試論系統(tǒng)植物學(xué)和進化植物學(xué)中的種下分類單位［J］.湘潭師范學(xué)院學(xué)報（社會科學(xué)版），1996，17（3）：43－46.

［22］Werlemark G.Genetic variability and reproductive strategies on Nordic dogroses，Rosa section Caninae［D］.Uppsala：Swedish University of Agricultural Sciences，2000.

［23］唐開學(xué).云南薔薇屬種質(zhì)資源研究［D］.昆明：云南大學(xué)，2009.

［24］周寧寧，唐開學(xué)，邱顯欽，等.云南峨眉薔薇天然居群的表型多樣性［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，22（6）：1732－1736.

［25］邵珠華，李名揚，邱顯欽，等.大花香水月季天然群體表型多樣性研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）：184－187.

［26］李樹發(fā)，李純佳，蹇洪英，等.云南香格里拉特有易危植物中甸刺玫的表型多樣性［J］.園藝學(xué)報，2013，40（5）：924－932.