葉 嘉，張倩茹，張 浩

（1.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北邯鄲056005；2.河北省高校資源植物應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北邯鄲056005）

隨著溫室大棚種植技術(shù)的普及，灰霉病已經(jīng)成為制約蔬菜培育生產(chǎn)的重要因素之一。灰霉病具有危害范圍廣、程度大、傳染速度快等特點，防治不當(dāng)將導(dǎo)致產(chǎn)量減少30%～50%，危害嚴(yán)重時甚至減產(chǎn)80%［1－2］。目前，黃瓜灰霉病主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治，包括苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、苯基氨基甲酸酯類殺菌劑等［3－6］。但因噴施化學(xué)農(nóng)藥引起的蔬菜抗藥性、農(nóng)藥殘留、有害生物再次猖獗等社會問題，將嚴(yán)重阻礙綠色、無公害蔬菜的發(fā)展潮流［7－8］。

苦參生物堿是最常見的植物源殺蟲物質(zhì)之一［9］，苦參生物堿農(nóng)藥制劑包括0.36%苦參生物堿水劑、1%苦參生物堿醇溶液、1.1%苦參生物堿粉劑等［10］，在國內(nèi)已被應(yīng)用于蔬菜、果樹、茶葉、煙草等病蟲害的防治中，但用于防治黃瓜灰霉病的研究較少。因此，本研究探討苦參生物堿對黃瓜灰霉病的防治效果，以期為植物源殺菌劑的開發(fā)與黃瓜幼苗抗病菌生產(chǎn)提供理論支撐和基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4%苦參生物堿水劑，購自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司；80%多菌靈可濕性粉劑，購自天津市漢邦植物保護(hù)劑有限責(zé)任公司；新津春4號黃瓜種子，購自山東省泰安市泰豐農(nóng)經(jīng)作物研究所。番茄灰霉菌野生型菌株38B1，由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，1 000 mL自來水，pH值自然。

1.2 試驗方法

本試驗于2016年2月9日至2016年5月11日，在河北省辛集市田家莊鄉(xiāng)耿家莊村大田進(jìn)行。

1.2.1 灰霉菌的活化和培養(yǎng) 將野生型灰霉菌菌株38B1接入PDA培養(yǎng)基上，在（28±1）℃無菌條件下培養(yǎng)48 h進(jìn)行菌株活化。2 d后，將活化的灰霉菌沿培養(yǎng)皿菌絲的邊緣打孔，取直徑為0.5 cm的菌絲塊并轉(zhuǎn)移至新的PDA固體培養(yǎng)基上，在（28±1）℃進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 菌絲體感染幼苗法 將培養(yǎng)5 d的灰霉菌置于培養(yǎng)皿中加入5mL無菌水配成菌絲液，用毛筆蘸取菌絲液并均勻涂抹到黃瓜子葉正面，每個操作重復(fù)3次，于（28±1）℃大棚中保溫保濕培養(yǎng)4 d后，觀察黃瓜幼苗的發(fā)病情況，并分別用0.1%、0.5%、1.0%、2.0%苦參生物堿溶液（試驗組），蒸餾水（陰性對照組），80%多菌靈可濕性粉劑（陽性對照組）對黃瓜幼苗進(jìn)行噴灑處理。

1.2.3 孢子懸浮液染菌法 選取直徑為6 mm的生長旺盛的灰霉菌的菌絲塊置于PDA平板中心位置，在（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)10 d后，在長滿灰霉菌孢子的PDA平板中注入5 mL無菌水，用無菌三角玻璃棒輕輕刮涂。將刮涂的液體倒入放有4層擦鏡紙的玻璃漏斗中，得到孢子懸浮液并流于錐形瓶。

從錐形瓶中吸取少量孢子懸浮液，滴入加蓋玻片的血球計數(shù)板中，并在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察，采用血球計數(shù)法計算孢子懸浮液的濃度。加入無菌水，將孢子懸浮液的濃度調(diào)整為5×105個／mL，制備50 mL孢子懸浮液。先用無菌針頭在黃瓜幼苗的子葉正面刺1個5 mm×5 mm的傷口，再將50 mL孢子懸浮液至于小噴壺中，對黃瓜幼苗的子葉正面進(jìn)行噴灑，每個操作重復(fù)3次，于（20±1）℃大棚中保溫保濕培養(yǎng)，4 d后觀察黃瓜幼苗的發(fā)病情況并進(jìn)行藥劑處理［11］。

1.2.4 黃瓜幼苗的培育 黃瓜種子萌發(fā)及幼苗培育：分別取100粒新津春4號黃瓜種子，按時間先后分成3批進(jìn)行萌發(fā)，每次萌發(fā)前，須要將新津春4號黃瓜種子加自來水室溫浸泡24 h，待種子吸水膨脹，萌發(fā)出2張子葉時，用作幼苗定植。苗床于溫室大棚中選取2 m×3 m土壤并澆濕，幼苗株距為0.1 m，行距為0.4 m。每次按時間先后將100粒黃瓜種子萌發(fā)成2張子葉定植后，再重新按苗床設(shè)計進(jìn)行幼苗的培育。將種子置于各個小區(qū)中并撒上均勻土質(zhì)加以覆蓋，待15 d后再將100粒新津春4號黃瓜種子如上操作進(jìn)行幼苗培育，直至3批黃瓜種子萌發(fā)結(jié)束。

黃瓜幼苗的定植：首先將試驗田區(qū)重新劃分為A（3.6 m×3.0 m）、B（3.6 m×3.0 m）2個區(qū)域。A區(qū)為2、4、6葉期黃瓜幼苗，用 0.1%、0.5%、1.0%、2.0%苦參生物堿溶液噴灑處理；B區(qū)為2、4、6葉期黃瓜幼苗，用1.0%苦參生物堿溶液噴灑處理。對于A區(qū)和B區(qū)，均將長勢均勻且葉片健康的6葉期（圖1）、4葉期（圖2）、2葉期（圖3）黃瓜幼苗分為3壟，每壟60棵，行距為0.50 m，株距為0.12 m。A區(qū)中每壟包括10棵陽性對照組黃瓜幼苗、10棵陰性對照組黃瓜幼苗、10棵01%苦參生物堿溶液試驗組黃瓜幼苗、10棵0.5%苦參生物堿溶液試驗組黃瓜幼苗、10棵1.0%苦參生物堿溶液試驗組黃瓜幼苗、10棵2.0%苦參生物堿溶液試驗組黃瓜幼苗；B區(qū)中每壟包括20棵陽性對照組黃瓜幼苗、20棵陰性對照組黃瓜幼苗、20棵10%苦參生物堿溶液試驗組黃瓜幼苗。

1.2.5 相對防效統(tǒng)計法 當(dāng)2、4、6葉期黃瓜幼苗通過菌絲體和孢子懸浮液染菌處理后，分別用0.1%、0.5%、1.0%、2.0%苦參生物堿溶液，蒸餾水，80%多菌靈溶液（溶液濃度為0.05 g／mL）對黃瓜幼苗進(jìn)行處理，各處理噴藥劑量均為45 mL。從噴藥3 d后開始，每3 d統(tǒng)計1次，對各組黃瓜幼苗持續(xù)觀測21 d，并統(tǒng)計葉片的發(fā)病程度（菌斑面積、葉片枯萎程度），計算病情指數(shù)和防治效果［12］：病情指數(shù)＝100×∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）／（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值）；相對防效＝（對照區(qū)病情指數(shù)－處理區(qū)病情指數(shù)）／對照區(qū)病情指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜幼苗的成苗率

由統(tǒng)計可得，300粒萌發(fā)的種子中發(fā)育成苗的有276粒，因此成苗率為92.0%，表明種子品質(zhì)良好。

2.2 黃瓜幼苗接菌結(jié)果

黃瓜葉片接菌5 d左右時，葉片表面出現(xiàn)淡灰褐色的霉層（圖4），后產(chǎn)生圓形或不規(guī)則形病斑（圖5），對于開花結(jié)果的黃瓜植株，灰霉菌多從開敗的雌花侵入，花瓣腐爛，并長出淡灰色的霉層，向幼果擴(kuò)展（圖6），致臍部呈水漬狀，幼果迅速變軟、萎縮、腐爛，幼果表面霉層濃密（圖7），符合黃瓜灰霉病的病癥。

2.3 不同濃度苦參生物堿溶液對2、4、6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防治效果

由表1可知，噴灑2葉期黃瓜幼苗的苦參生物堿溶液處理中，當(dāng)苦參生物堿溶液的濃度為0.5%時，對黃瓜葉片灰霉病的病情指數(shù)最小值、相對防效最大值分別為5.6、80.8%，此時相對防效的極差最大，為64.9百分點，即極差越大，防治效果越明顯，因此，當(dāng)苦參生物堿溶液濃度為0.5%時，對2葉期黃瓜幼苗的灰霉病防治效果最佳。由表2可知，當(dāng)向4葉期黃瓜幼苗噴灑0.5%苦參生物堿溶液時，對黃瓜葉片灰霉病的病情指數(shù)最小值、相對防效最大值分別為3.1、879%，此時相對防效的極差最大，為71.7百分點，因此，當(dāng)苦參生物堿溶液濃度為0.5%時，對4葉期黃瓜幼苗灰霉病的防治效果最佳。由表3可知，當(dāng)用1.0%的苦參生物堿溶液噴灑6葉期黃瓜幼苗時，黃瓜葉片灰霉病的病情指數(shù)最小值為1.9，且相對防效與極差均最大，分別為91.7%、74.2百分點，因此苦參生物堿溶液濃度為1.0%時，對6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防治效果最佳。

表1 不同濃度苦參生物堿溶液對2葉期黃瓜灰霉病的病情指數(shù)和相對防效

表2 不同濃度苦參生物堿溶液對4葉期黃瓜灰霉病的病情指數(shù)和相對防效

表3 不同濃度苦參生物堿溶液對6葉期黃瓜灰霉病的病情指數(shù)和相對防效

2.4 1.0%苦參生物堿溶液對2、4、6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防治效果

由圖8可知，當(dāng)苦參生物堿濃度為1.0%時，對2葉期黃瓜幼苗灰霉病的防效在3～15 d內(nèi)逐漸增大，但在15 d后防效呈下降趨勢；對4、6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防效在3～12 d內(nèi)逐漸增大，12 d后防效呈下降趨勢。1.0%苦參生物堿溶液對2、4、6葉期黃瓜幼苗灰霉病防效的高峰期分別在噴藥15、12、12 d后，此時，對2、4、6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防效分別為 74.2%、80.2%、91.7%。

2.5 不同濃度的苦參生物堿溶液對6葉期黃瓜幼苗灰霉病的抑制效果

6葉期黃瓜幼苗葉片染病后，葉片由柔軟逐漸變硬，顏色由翠綠色逐漸出現(xiàn)白色絨毛、變黃，一些葉片甚至出現(xiàn)白斑，最后淡灰褐色霉層加重（圖9）。但經(jīng)多菌靈（圖10）和不同濃度苦參生物堿（圖11～圖14）噴灑后，感染灰霉病病菌的葉片逐漸變干，其他感染灰霉病病菌的葉片，菌斑不再擴(kuò)大。

3 結(jié)論

在試驗范圍內(nèi)，苦參生物堿溶液對2、4、6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防治效果呈先升后降的趨勢，其中，1.0%苦參生物堿溶液對6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防效最佳，0.5%苦參生物堿溶液對2、4葉期黃瓜幼苗灰霉病的防效最佳。苦參生物堿可以成功抑制灰霉病病菌菌絲的生長，控制或減弱其生長蔓延趨勢，從而抑制灰霉病病菌對黃瓜葉片的侵染與破壞，達(dá)到抑菌效果?？鄥⑸飰A對6葉期幼苗灰霉病的最佳防效濃度比對2、4葉期的高，這與不同苗期幼苗自身生長及生理狀況有關(guān)。2、4葉期黃瓜幼苗較稚嫩，高濃度的藥劑可能會破壞2、4葉期幼苗葉片中葉肉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞膜等）；而6葉期黃瓜幼苗自身抗病能力較強(qiáng)，其葉片結(jié)構(gòu)與生長發(fā)育比2、4葉期更完整、旺盛，因此2、4葉期的最佳防效濃度低于6葉期。從整體上看，試驗組的防效低于陽性對照組。但苦參生物堿易獲取、危害小、不產(chǎn)生二次污染等特點，使其成為綠色農(nóng)藥的首選。

參考文獻(xiàn)：

［1］禹化強(qiáng).大棚黃瓜主要病害的防治研究［J］.中國果菜，2015，35（2）：48－52.

［2］趙麗萍，李永燦，趙統(tǒng)敏，等.灰霉菌毒素誘導(dǎo)番茄抗性突變體及相關(guān)防御酶活性［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，32（3）：631－639.

［3］祁連弟.沼液及不同藥劑對大棚黃瓜灰霉病防治效果的研究［J］.中國沼氣，2014，32（4）：73－75.

［4］楊紅玉，李 湘，張一凡，等.灰霉菌培養(yǎng)及其對擬南芥的侵染［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2005，18（4）：431－434.

［5］陳治芳.殺菌劑混合物對番茄灰霉病菌毒力增效研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［6］石延霞，唐 明，晉知文，等.蔬菜作物灰葡萄孢菌對不同類型殺菌劑的抗性評價［J］.中國蔬菜，2016（3）：60－65.

［7］林 濤，樊建麟，楊東順，等.甜椒中噻苯隆的測定及其殘留動態(tài)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，32（3）：694－697.

［8］陸 凡.江蘇省生物農(nóng)藥生產(chǎn)現(xiàn)狀、存在問題及發(fā)展建議［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，32（1）：56－66.

［9］李 明，劉彥文.生物農(nóng)藥在害蟲防治上的應(yīng)用［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，27（2）：143－145.

［10］王玉龍，關(guān)扎根，賈學(xué)思，等.苦參堿在農(nóng)業(yè)害蟲防治中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（4）：424－428.

［11］喻大昭，楊小軍，楊立軍，等.49種植物源粗提物對黃瓜灰霉菌的生物活性篩選［J］.植物保護(hù)學(xué)報，2004，31（2）：217－218.

［12］宋玉立，楊共強(qiáng)，何文蘭.3種殺菌劑對小麥葉銹病的防治效果［J］.植物保護(hù)，2004，30（1）：76－77.