葉 嘉,張倩茹,張 浩
(1.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,河北邯鄲056005;2.河北省高校資源植物應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心,河北邯鄲056005)
隨著溫室大棚種植技術(shù)的普及,灰霉病已經(jīng)成為制約蔬菜培育生產(chǎn)的重要因素之一?;颐共【哂形:Ψ秶鷱V、程度大、傳染速度快等特點(diǎn),防治不當(dāng)將導(dǎo)致產(chǎn)量減少30%~50%,危害嚴(yán)重時(shí)甚至減產(chǎn)80%[1-2]。目前,黃瓜灰霉病主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治,包括苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、苯基氨基甲酸酯類殺菌劑等[3-6]。但因噴施化學(xué)農(nóng)藥引起的蔬菜抗藥性、農(nóng)藥殘留、有害生物再次猖獗等社會(huì)問題,將嚴(yán)重阻礙綠色、無公害蔬菜的發(fā)展潮流[7-8]。
苦參生物堿是最常見的植物源殺蟲物質(zhì)之一[9],苦參生物堿農(nóng)藥制劑包括0.36%苦參生物堿水劑、1%苦參生物堿醇溶液、1.1%苦參生物堿粉劑等[10],在國內(nèi)已被應(yīng)用于蔬菜、果樹、茶葉、煙草等病蟲害的防治中,但用于防治黃瓜灰霉病的研究較少。因此,本研究探討苦參生物堿對(duì)黃瓜灰霉病的防治效果,以期為植物源殺菌劑的開發(fā)與黃瓜幼苗抗病菌生產(chǎn)提供理論支撐和基礎(chǔ)資料。
4%苦參生物堿水劑,購自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司;80%多菌靈可濕性粉劑,購自天津市漢邦植物保護(hù)劑有限責(zé)任公司;新津春4號(hào)黃瓜種子,購自山東省泰安市泰豐農(nóng)經(jīng)作物研究所。番茄灰霉菌野生型菌株38B1,由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所提供。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基:200 g馬鈴薯,20 g葡萄糖,15~20 g瓊脂,1 000 mL自來水,pH值自然。
本試驗(yàn)于2016年2月9日至2016年5月11日,在河北省辛集市田家莊鄉(xiāng)耿家莊村大田進(jìn)行。
1.2.1 灰霉菌的活化和培養(yǎng) 將野生型灰霉菌菌株38B1接入PDA培養(yǎng)基上,在(28±1)℃無菌條件下培養(yǎng)48 h進(jìn)行菌株活化。2 d后,將活化的灰霉菌沿培養(yǎng)皿菌絲的邊緣打孔,取直徑為0.5 cm的菌絲塊并轉(zhuǎn)移至新的PDA固體培養(yǎng)基上,在(28±1)℃進(jìn)行培養(yǎng)。
1.2.2 菌絲體感染幼苗法 將培養(yǎng)5 d的灰霉菌置于培養(yǎng)皿中加入5mL無菌水配成菌絲液,用毛筆蘸取菌絲液并均勻涂抹到黃瓜子葉正面,每個(gè)操作重復(fù)3次,于(28±1)℃大棚中保溫保濕培養(yǎng)4 d后,觀察黃瓜幼苗的發(fā)病情況,并分別用0.1%、0.5%、1.0%、2.0%苦參生物堿溶液(試驗(yàn)組),蒸餾水(陰性對(duì)照組),80%多菌靈可濕性粉劑(陽性對(duì)照組)對(duì)黃瓜幼苗進(jìn)行噴灑處理。
1.2.3 孢子懸浮液染菌法 選取直徑為6 mm的生長(zhǎng)旺盛的灰霉菌的菌絲塊置于PDA平板中心位置,在(28±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)10 d后,在長(zhǎng)滿灰霉菌孢子的PDA平板中注入5 mL無菌水,用無菌三角玻璃棒輕輕刮涂。將刮涂的液體倒入放有4層擦鏡紙的玻璃漏斗中,得到孢子懸浮液并流于錐形瓶。
從錐形瓶中吸取少量孢子懸浮液,滴入加蓋玻片的血球計(jì)數(shù)板中,并在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察,采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算孢子懸浮液的濃度。加入無菌水,將孢子懸浮液的濃度調(diào)整為5×105個(gè)/mL,制備50 mL孢子懸浮液。先用無菌針頭在黃瓜幼苗的子葉正面刺1個(gè)5 mm×5 mm的傷口,再將50 mL孢子懸浮液至于小噴壺中,對(duì)黃瓜幼苗的子葉正面進(jìn)行噴灑,每個(gè)操作重復(fù)3次,于(20±1)℃大棚中保溫保濕培養(yǎng),4 d后觀察黃瓜幼苗的發(fā)病情況并進(jìn)行藥劑處理[11]。
1.2.4 黃瓜幼苗的培育 黃瓜種子萌發(fā)及幼苗培育:分別取100粒新津春4號(hào)黃瓜種子,按時(shí)間先后分成3批進(jìn)行萌發(fā),每次萌發(fā)前,須要將新津春4號(hào)黃瓜種子加自來水室溫浸泡24 h,待種子吸水膨脹,萌發(fā)出2張子葉時(shí),用作幼苗定植。苗床于溫室大棚中選取2 m×3 m土壤并澆濕,幼苗株距為0.1 m,行距為0.4 m。每次按時(shí)間先后將100粒黃瓜種子萌發(fā)成2張子葉定植后,再重新按苗床設(shè)計(jì)進(jìn)行幼苗的培育。將種子置于各個(gè)小區(qū)中并撒上均勻土質(zhì)加以覆蓋,待15 d后再將100粒新津春4號(hào)黃瓜種子如上操作進(jìn)行幼苗培育,直至3批黃瓜種子萌發(fā)結(jié)束。
黃瓜幼苗的定植:首先將試驗(yàn)田區(qū)重新劃分為A(3.6 m×3.0 m)、B(3.6 m×3.0 m)2個(gè)區(qū)域。A區(qū)為2、4、6葉期黃瓜幼苗,用 0.1%、0.5%、1.0%、2.0%苦參生物堿溶液噴灑處理;B區(qū)為2、4、6葉期黃瓜幼苗,用1.0%苦參生物堿溶液噴灑處理。對(duì)于A區(qū)和B區(qū),均將長(zhǎng)勢(shì)均勻且葉片健康的6葉期(圖1)、4葉期(圖2)、2葉期(圖3)黃瓜幼苗分為3壟,每壟60棵,行距為0.50 m,株距為0.12 m。A區(qū)中每壟包括10棵陽性對(duì)照組黃瓜幼苗、10棵陰性對(duì)照組黃瓜幼苗、10棵01%苦參生物堿溶液試驗(yàn)組黃瓜幼苗、10棵0.5%苦參生物堿溶液試驗(yàn)組黃瓜幼苗、10棵1.0%苦參生物堿溶液試驗(yàn)組黃瓜幼苗、10棵2.0%苦參生物堿溶液試驗(yàn)組黃瓜幼苗;B區(qū)中每壟包括20棵陽性對(duì)照組黃瓜幼苗、20棵陰性對(duì)照組黃瓜幼苗、20棵10%苦參生物堿溶液試驗(yàn)組黃瓜幼苗。
1.2.5 相對(duì)防效統(tǒng)計(jì)法 當(dāng)2、4、6葉期黃瓜幼苗通過菌絲體和孢子懸浮液染菌處理后,分別用0.1%、0.5%、1.0%、2.0%苦參生物堿溶液,蒸餾水,80%多菌靈溶液(溶液濃度為0.05 g/mL)對(duì)黃瓜幼苗進(jìn)行處理,各處理噴藥劑量均為45 mL。從噴藥3 d后開始,每3 d統(tǒng)計(jì)1次,對(duì)各組黃瓜幼苗持續(xù)觀測(cè)21 d,并統(tǒng)計(jì)葉片的發(fā)病程度(菌斑面積、葉片枯萎程度),計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[12]:病情指數(shù)=100×∑(各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值);相對(duì)防效=(對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù))/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100%。
由統(tǒng)計(jì)可得,300粒萌發(fā)的種子中發(fā)育成苗的有276粒,因此成苗率為92.0%,表明種子品質(zhì)良好。
黃瓜葉片接菌5 d左右時(shí),葉片表面出現(xiàn)淡灰褐色的霉層(圖4),后產(chǎn)生圓形或不規(guī)則形病斑(圖5),對(duì)于開花結(jié)果的黃瓜植株,灰霉菌多從開敗的雌花侵入,花瓣腐爛,并長(zhǎng)出淡灰色的霉層,向幼果擴(kuò)展(圖6),致臍部呈水漬狀,幼果迅速變軟、萎縮、腐爛,幼果表面霉層濃密(圖7),符合黃瓜灰霉病的病癥。
由表1可知,噴灑2葉期黃瓜幼苗的苦參生物堿溶液處理中,當(dāng)苦參生物堿溶液的濃度為0.5%時(shí),對(duì)黃瓜葉片灰霉病的病情指數(shù)最小值、相對(duì)防效最大值分別為5.6、80.8%,此時(shí)相對(duì)防效的極差最大,為64.9百分點(diǎn),即極差越大,防治效果越明顯,因此,當(dāng)苦參生物堿溶液濃度為0.5%時(shí),對(duì)2葉期黃瓜幼苗的灰霉病防治效果最佳。由表2可知,當(dāng)向4葉期黃瓜幼苗噴灑0.5%苦參生物堿溶液時(shí),對(duì)黃瓜葉片灰霉病的病情指數(shù)最小值、相對(duì)防效最大值分別為3.1、879%,此時(shí)相對(duì)防效的極差最大,為71.7百分點(diǎn),因此,當(dāng)苦參生物堿溶液濃度為0.5%時(shí),對(duì)4葉期黃瓜幼苗灰霉病的防治效果最佳。由表3可知,當(dāng)用1.0%的苦參生物堿溶液噴灑6葉期黃瓜幼苗時(shí),黃瓜葉片灰霉病的病情指數(shù)最小值為1.9,且相對(duì)防效與極差均最大,分別為91.7%、74.2百分點(diǎn),因此苦參生物堿溶液濃度為1.0%時(shí),對(duì)6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防治效果最佳。
表1 不同濃度苦參生物堿溶液對(duì)2葉期黃瓜灰霉病的病情指數(shù)和相對(duì)防效
表2 不同濃度苦參生物堿溶液對(duì)4葉期黃瓜灰霉病的病情指數(shù)和相對(duì)防效
表3 不同濃度苦參生物堿溶液對(duì)6葉期黃瓜灰霉病的病情指數(shù)和相對(duì)防效
由圖8可知,當(dāng)苦參生物堿濃度為1.0%時(shí),對(duì)2葉期黃瓜幼苗灰霉病的防效在3~15 d內(nèi)逐漸增大,但在15 d后防效呈下降趨勢(shì);對(duì)4、6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防效在3~12 d內(nèi)逐漸增大,12 d后防效呈下降趨勢(shì)。1.0%苦參生物堿溶液對(duì)2、4、6葉期黃瓜幼苗灰霉病防效的高峰期分別在噴藥15、12、12 d后,此時(shí),對(duì)2、4、6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防效分別為 74.2%、80.2%、91.7%。
6葉期黃瓜幼苗葉片染病后,葉片由柔軟逐漸變硬,顏色由翠綠色逐漸出現(xiàn)白色絨毛、變黃,一些葉片甚至出現(xiàn)白斑,最后淡灰褐色霉層加重(圖9)。但經(jīng)多菌靈(圖10)和不同濃度苦參生物堿(圖11~圖14)噴灑后,感染灰霉病病菌的葉片逐漸變干,其他感染灰霉病病菌的葉片,菌斑不再擴(kuò)大。
在試驗(yàn)范圍內(nèi),苦參生物堿溶液對(duì)2、4、6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防治效果呈先升后降的趨勢(shì),其中,1.0%苦參生物堿溶液對(duì)6葉期黃瓜幼苗灰霉病的防效最佳,0.5%苦參生物堿溶液對(duì)2、4葉期黃瓜幼苗灰霉病的防效最佳??鄥⑸飰A可以成功抑制灰霉病病菌菌絲的生長(zhǎng),控制或減弱其生長(zhǎng)蔓延趨勢(shì),從而抑制灰霉病病菌對(duì)黃瓜葉片的侵染與破壞,達(dá)到抑菌效果??鄥⑸飰A對(duì)6葉期幼苗灰霉病的最佳防效濃度比對(duì)2、4葉期的高,這與不同苗期幼苗自身生長(zhǎng)及生理狀況有關(guān)。2、4葉期黃瓜幼苗較稚嫩,高濃度的藥劑可能會(huì)破壞2、4葉期幼苗葉片中葉肉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞膜等);而6葉期黃瓜幼苗自身抗病能力較強(qiáng),其葉片結(jié)構(gòu)與生長(zhǎng)發(fā)育比2、4葉期更完整、旺盛,因此2、4葉期的最佳防效濃度低于6葉期。從整體上看,試驗(yàn)組的防效低于陽性對(duì)照組。但苦參生物堿易獲取、危害小、不產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn),使其成為綠色農(nóng)藥的首選。
參考文獻(xiàn):
[1]禹化強(qiáng).大棚黃瓜主要病害的防治研究[J].中國果菜,2015,35(2):48-52.
[2]趙麗萍,李永燦,趙統(tǒng)敏,等.灰霉菌毒素誘導(dǎo)番茄抗性突變體及相關(guān)防御酶活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,32(3):631-639.
[3]祁連弟.沼液及不同藥劑對(duì)大棚黃瓜灰霉病防治效果的研究[J].中國沼氣,2014,32(4):73-75.
[4]楊紅玉,李 湘,張一凡,等.灰霉菌培養(yǎng)及其對(duì)擬南芥的侵染[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,18(4):431-434.
[5]陳治芳.殺菌劑混合物對(duì)番茄灰霉病菌毒力增效研究[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.
[6]石延霞,唐 明,晉知文,等.蔬菜作物灰葡萄孢菌對(duì)不同類型殺菌劑的抗性評(píng)價(jià)[J].中國蔬菜,2016(3):60-65.
[7]林 濤,樊建麟,楊東順,等.甜椒中噻苯隆的測(cè)定及其殘留動(dòng)態(tài)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,32(3):694-697.
[8]陸 凡.江蘇省生物農(nóng)藥生產(chǎn)現(xiàn)狀、存在問題及發(fā)展建議[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,32(1):56-66.
[9]李 明,劉彥文.生物農(nóng)藥在害蟲防治上的應(yīng)用[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,27(2):143-145.
[10]王玉龍,關(guān)扎根,賈學(xué)思,等.苦參堿在農(nóng)業(yè)害蟲防治中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(4):424-428.
[11]喻大昭,楊小軍,楊立軍,等.49種植物源粗提物對(duì)黃瓜灰霉菌的生物活性篩選[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),2004,31(2):217-218.
[12]宋玉立,楊共強(qiáng),何文蘭.3種殺菌劑對(duì)小麥葉銹病的防治效果[J].植物保護(hù),2004,30(1):76-77.