范東海，趙麗麗，常桂英

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101）

植物內(nèi)生菌是指生活史的某一或全部時(shí)期生活于健康植物體內(nèi)，而又不引起寄主植物明顯病害癥狀的細(xì)菌或真菌，它與植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了互惠共生相互依存的關(guān)系［1］。

烏腺金絲桃（Hypericum attenuatum）別稱穩(wěn)心草、趕山鞭，屬于植物界、被子植物門、木蘭綱、山茶目、藤黃科（Guttiferae）金絲桃屬（Hypericum）植物［2］，作為中草藥在民間廣為使用。高度0.3～0.7 m，有發(fā)達(dá)的側(cè)根和須根。莖豎直生長(zhǎng)，植株上有許多黑色斑點(diǎn)分散生長(zhǎng)，因而得名烏腺金絲桃。烏腺金絲桃葉片呈長(zhǎng)卵形，花瓣五瓣、黃色，生長(zhǎng)在植物頂端，果實(shí)深棕色、卵圓形，種子為細(xì)長(zhǎng)的小圓柱形。一般在每年的7—8月間開(kāi)花，在8—9月間結(jié)果。烏腺金絲桃大多分布在潮濕的小山丘、土坡、山腳路邊的草叢、草原、石礫地、林地及其周圍，廣泛生長(zhǎng)于中國(guó)黑龍江、吉林、遼寧及內(nèi)蒙古等地區(qū)。金絲桃屬植物的化學(xué)成分研究結(jié)果表明，該屬植物主要含有二蒽酮類、黃酮類、間苯三酚類和芳香酸類［3－4］化合物等化學(xué)成分，具有抗菌消炎、收斂止血以及治療黃疸、肝炎及瘡癤腫毒的作用，對(duì)心律失常、心肌缺血、心衰和增強(qiáng)免疫力等具有較好的功效，同時(shí)還具有抗抑郁、抗腫瘤及抗病毒等活性［5］。尤其是其中的黃酮成分對(duì)心律失常、心肌缺血、心衰、抑郁等心血管疾病具有很強(qiáng)的藥理活性。研究采用根段直接培養(yǎng)法［6］，將傳統(tǒng)形態(tài)分類與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)烏腺金絲桃根部真菌進(jìn)行分離、鑒定，旨在為開(kāi)展植物真菌研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

烏腺金絲桃全草（采自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院烏腺金絲桃栽培基地）。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 乙醇（分析純），氯化汞（分析純），液氮，二甲苯（分析純），PDA配方：馬鈴薯200 g、水1 L、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，pH值自然。

1.2.2 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋（MLS－3751L－PC，松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社）；超凈工作臺(tái)（SW－CJ－ZFD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；智能光照培養(yǎng)箱（PGX－350A，喬楓實(shí)業(yè)有限公司）；冰箱（BCD－221TMBA，青島海爾股份有限公司）；高速離心機(jī)（HC－2514，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；PCR擴(kuò)增儀（THERM－1000，美國(guó)AXYGEN公司）；電泳儀（JY600，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；凝膠成像儀（Image Quant LAS500，美國(guó)通用電氣）。

1.3 方法與準(zhǔn)備

1.3.1 材料的預(yù)處理 取健壯的纖細(xì)根用自來(lái)水沖洗干凈，剪成1～2 cm段長(zhǎng)。

1.3.2 消毒方法和時(shí)間選擇 75%乙醇消毒30 s→無(wú)菌水沖洗3～4次→無(wú)菌濾紙吸干→0.1%氯化汞消毒1 min→無(wú)菌水清洗3～4次→無(wú)菌濾紙吸干

1.3.3 菌株的分離與純化 將處理好的根段置于PDA培養(yǎng)基上，每皿接4段，10個(gè)重復(fù)，于25℃恒溫培養(yǎng)。待菌絲從根段的橫切面長(zhǎng)出，并圍繞根段生長(zhǎng)形成菌落后，挑取尖端菌絲接于培養(yǎng)基中，純化。純化后的菌株轉(zhuǎn)接在試管斜面培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱內(nèi)保存，備用。同時(shí)將最后1次無(wú)菌水沖洗液涂布于培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)，作為對(duì)照判斷表面消毒是否徹底。

1.3.4 內(nèi)生真菌種屬鑒定 對(duì)分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行顯微形態(tài)觀察，根據(jù)其菌絲體顏色、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及有無(wú)橫隔等特征，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定［7－8］。除形態(tài)學(xué)鑒定外，通過(guò)分子生物學(xué)手段，通過(guò)擴(kuò)增分析真菌rDNA的ITS序列，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。

1.3.5 菌根真菌基因組DNA的提取 用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法［9］提取真菌基因組DNA，在用酚－三氯甲烷提取前單獨(dú)用酚抽提1次，除去蛋白質(zhì)。

1.3.5.1 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè) 選用的引物序列為：ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCG－3′；ITS4：5′－TCCTCCGCTTA TTGATATGC－3′。用于 ITS擴(kuò)增的 PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火1 min，72℃后延伸10 min，45個(gè)循環(huán)；72℃延伸30 s。

表1 ITS擴(kuò)增的PCR 50μL反應(yīng)體系

1.3.5.2 鑒定 取 5μL PCR產(chǎn)物，用 1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，由北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 將獲得的菌根真菌的ITS全序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇同源性較高的序列。使用ClustalX1.81軟件對(duì)篩選出的序列進(jìn)行全序列多重比對(duì)，用MEGA5.1軟件計(jì)算遺傳距離，并以相應(yīng)的種屬為外群進(jìn)一步采用N－J法聚類構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.6 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌效果 （1）烏腺金絲桃醇溶物的提?。翰烧獮跸俳鸾z桃全草，洗凈，將其干燥，80%乙醇浸提 12 h，收集醇溶液［10－12］，提取浸膏，干燥，用真空冷凍抽濾機(jī)干燥得結(jié)晶物，置于－40℃下儲(chǔ)存，備用。（2）供試菌液的制備：LB培養(yǎng)基的配制與滅菌→細(xì)菌的活化（37℃、24 h）→配制菌懸液備用。（3）濾紙片法抑菌效果測(cè)定：制備4種濃度分別為2、4、6、8 mg／mL的烏腺金絲桃醇溶物。采用濾紙片法，將直徑為10 mm的濾紙片滅菌后，分別浸泡于各濃度胞外粗提物溶液中2 h，分別吸取0.4 mL各供試菌懸液涂布于培養(yǎng)皿上，且以無(wú)菌生理鹽水組作對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，置于37℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)量各供試菌在不同濃度下的抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基觀察結(jié)果

從烏腺金絲桃根中分離出1株于PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的優(yōu)勢(shì)菌株，編號(hào)A85276。由圖1、圖2可知，菌落棉絮狀，菌絲緊密生長(zhǎng)，正面中部呈淺黃色，邊緣呈白色；后期邊緣呈粉紅色，波浪狀。菌絲有隔，分枝，孢子呈圓柱形。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

由所得的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）可知，三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）與編號(hào)菌株A85276相似度很高，而且處于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一分枝上，可證明所分離得到的菌株為三線鐮刀菌。

表2 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌效果

2.3 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌作用

由表2可見(jiàn)，烏腺金絲桃醇溶物的濃度越高，烏腺金絲桃醇溶物的抑菌圈直徑整體越大，說(shuō)明胞外粗提物的濃度與抑菌效果呈正相關(guān)關(guān)系；同時(shí)，沙門氏菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抑菌圈直徑比較長(zhǎng)，而四聯(lián)球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌圈直徑與革蘭氏陰性菌相比較短?？赡艿脑蚴歉锾m氏陽(yáng)性菌能產(chǎn)生外毒素，在菌體開(kāi)始生長(zhǎng)的階段，代謝旺盛，細(xì)胞增殖快，外毒素含量高，對(duì)烏腺金絲桃醇溶物的活性破壞作用強(qiáng)，產(chǎn)生的抑菌效果不明顯；革蘭氏陰性菌能產(chǎn)生內(nèi)毒素，在菌體生長(zhǎng)階段，代謝旺盛，細(xì)胞增殖快，也有少量衰亡、死亡的細(xì)胞會(huì)釋放出內(nèi)毒素，但含量低，對(duì)烏腺金絲桃醇溶物的活性破壞作用弱，產(chǎn)生的抑菌效果明顯。

3 結(jié)論與討論

采用根段直接培養(yǎng)法分離烏腺金絲桃內(nèi)生真菌，在形態(tài)、分子鑒定的基礎(chǔ)上，將來(lái)自藥用植物烏腺金絲桃根部的1株內(nèi)生真菌鑒定為三線鐮刀菌。其對(duì)烏腺金絲桃的生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響還需要進(jìn)一步研究。抑菌試驗(yàn)表明，烏腺金絲桃醇溶物對(duì)細(xì)菌有抑制作用，并與醇溶物濃度呈正相關(guān)，推測(cè)其醇溶物中可能含有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的化學(xué)成分，未來(lái)可能在生物防治等方面提供作用。

綜上所述，菌根研究的不斷壯大，在一定程度上可豐富其他相關(guān)學(xué)科的內(nèi)容，并促進(jìn)其發(fā)展。特別是現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的今天，基于學(xué)科之間的聯(lián)合、相互滲透的大趨勢(shì)，菌根研究對(duì)其他相關(guān)學(xué)科的進(jìn)展將發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

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