李 麗，孫 健，何雪梅，李昌寶，零東寧，饒川艷，肖占仕，盛金鳳，鄭鳳錦，易 萍

（1.廣西農業(yè)科學院農產品加工研究所，廣西南寧530007；2.廣西果蔬貯藏與加工新技術重點實驗室培育基地，廣西南寧530007）

磷脂酶D（phospholipase D，簡稱PLD），全稱磷脂酰膽堿磷脂水解酶（EC3.1.4.4），是一類催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換的酶的總稱，能水解不同膜磷脂產生磷脂酸（phosphatidic acid，簡稱PA）和各種頭部基團，如膽堿或乙醇胺等。PLD可以在植物各個組織器官（根、莖、葉、種子、果實等）中廣泛表達，且集中于生長代謝旺盛的部位，如成熟初期的種子和萌芽初期的幼苗［1－2］。前期研究表明，PLD在脂類代謝和細胞調控方面有多重功能，參與了從激素信號傳遞到環(huán)境脅迫響應的胞內及亞細胞內的各種動態(tài)過程［3－4］。PLD水解磷脂產物PA還可作為第二信使，參與胞內信號傳遞過程，觸發(fā)胞內與抗性（抗逆性和抗病性等）相關的“程序化反應”來響應逆境［5］。因此，PLD是兼具水解作用和信息傳遞作用的雙重功能酶，在植物生長發(fā)育和抗逆過程中起到重要的作用。

PLD參與植物對環(huán)境逆境脅迫的響應，研究表明，逆境脅迫（機械損傷、冷害、干旱、高鹽、營養(yǎng)不良及病蟲害）等均能誘導植物PLD的活性發(fā)生變化，從而導致磷脂降解、膜通透性改變，最終造成植物傷害甚至死亡［6］。如果能在適當范圍內對PLD的活性進行調控，能在一定程度上改變植物對逆境的響應，有助于細胞膜結構的保持和細胞內區(qū)域化結構的完整，減少植物受到的傷害。本文結合作者的研究工作，通過對磷脂酶D與植物逆境脅迫關系的論述，探討PLD在機械損傷、低溫、干旱和微生物等不同非生物、生物脅迫下的響應機制，為進一步針對植物逆境脅迫調控方法的研究提供參考。

1 磷脂酶D基因差異表達特性

磷脂既是生物膜的骨架成分，又能通過水解產物來參與多種生理過程和環(huán)境刺激誘發(fā)的細胞反應。磷脂酶是催化磷脂水解第一步的關鍵酶，根據水解磷脂部位的不同將磷脂酶分為 5類，即磷脂酶 A1（PLA1）、磷脂酶 A2（PLA2）、磷脂酶 B（PLB）、磷脂酶 C（PLC）和磷脂酶 D（PLD）［7］。磷脂酶的催化活性表現在脂類代謝、膜再建、脂類信號分子（如三磷酸肌醇、二酰基甘油、磷脂酸）和游離脂肪酸等的產生方面［8］。近年來的研究表明，磷脂酶幾乎在植物所有生命階段及對環(huán)境的應答中起著非常重要的作用［9－14］，而PLD在組織衰老及果實采后老化的細胞膜降解過程中起重要作用。在許多植物中，如黃瓜、蓖麻、番茄、獼猴桃、甘藍、煙草、玉米、豇豆、草莓、龍眼等老化的果實中都觀察到了PLD活性的增強和PA的形成［15］。前期研究發(fā)現，通過調節(jié)磷脂酶D活性，可降低水果果實貯藏期間的褐變與感病指數，減緩果皮褐變及采后果實衰老劣變［16－17］。

PLD參與細胞膜的降解及生物合成，因而它對保持細胞膜穩(wěn)定性及生理功能起著重要的調控作用。植物中包含多個不同類別的PLD基因，但各種PLD在不同植物種類、器官、組織和細胞類型中表現出特異性和不同的作用調控機制，如不同的PLD能特異性地降解不同的膜磷脂。此外，PLD參與膜的生物合成及降解，它被激活后能夠改變細胞膜中脂質組分，從而影響細胞膜在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性［6］。國內外研究發(fā)現，植物中PLD的總體結構域相似，但是在某些單元上不同類型之間存在重要的差異，它們各具獨特的生物化學特性，因此，不同的PLD在不同脅迫條件下表現出特異的功能［18］。Katagiri等在對擬南芥PLD活性的研究中發(fā)現，PLDδ與質膜緊密相連，并在老葉、莖、花及根中具有相對高的表達活性［19］。You等研究表明，PLDδ基因在不同組織中的有明顯的特異性表達（花芽＜花、幼葉＜老葉），其中在相對表達差異最大的成花組織中，花的相對表達量為花芽的2.86倍［20］。綜合上述結果表明，PLD在植物生長發(fā)育的不同階段及響應外界環(huán)境因子刺激的信號轉導過程中均起著重要的調節(jié)作用。

2 磷脂酶D基因在植物逆境脅迫信號轉導中的作用

2.1 病原菌微生物侵染

植物在受到病原微生物逆境脅迫時，通常也會發(fā)生一系列的抗逆反應。研究發(fā)現，PLD會富集于微生物與質膜的接觸部位，引起酶活性及亞細胞定位發(fā)生變化，以抵御病原菌的侵染，PLD在植物抵御病害的防衛(wèi)信號產生中不可或缺［21］。在植物與病原菌的相互作用過程中，短時間內改變PLD活性可能會引起植物對病原菌的敏感性發(fā)生變化，而長期改變PLD活性則可能會引起細胞骨架改變和膜的重新組裝（或降解）。

病原菌侵染植物體時，會激活植物的PLD，使其活性發(fā)生變化，并且參與到植物抵御病原侵染時的超敏反應（hypersensitive response）過程中［22－23］。Young等用黃單胞菌侵染水稻抗性株和敏感株時，敏感株的PLD蛋白在第5天就很難被檢測到，此時植株表現出病斑擴大、葉片發(fā)黑干枯的感病表型，而抗性株的PLD活性則一直保持較高水平［22］。王蓮蓮采用熒光標記PLD觀察的結果表明，在病原菌侵染敏感性水稻葉片后24 h內，PLD在質膜內側均勻分布，而侵染抗性植株12 h后，PLD在病原菌侵染的細胞質膜一側集中分布，這表明PLD的分布和表達差異可能造成植株抗病性的差異［24］。當白葉枯病病原菌侵染水稻時，PLDα活性明顯提高，且抗病性品種更為顯著，PLDα聚集于病原菌與植物接觸的質膜部位，暗示PLDα可能在抵御病菌的過程中起作用［25］。用真菌激發(fā)子木聚糖酶處理煙草細胞時，PLDβ和PLDγ水解的產物N－乙酰乙醇胺（N－acetylethanolamine，簡稱NAE）很快釋放，說明PLDβ和PLDγ在抗病中具有一定的作用［26－27］。在豆類幼苗期，致瘤因素（包括病原菌微生物）能激活PLD，通過減少受n－丁醇抑制根毛的變形而促進PA的合成［28］。

2.2 干旱脅迫

干旱脅迫導致的植物代謝紊亂與PLD活性變化密切相關，但是其作用機制與機械損傷和低溫脅迫相比又有所不同。植物激素脫落酸（簡稱ABA）在調節(jié)植物滲透脅迫應答中起著重要作用。在滲透脅迫下，會誘導植物內源脫落酸濃度增加并激活PLD（圖1），而PLD活性的增加主要是為了響應脫落酸信號［29］。脫落酸濃度增加的同時誘導葉片保衛(wèi)細胞氣孔關閉，這一過程有利于維持干旱脅迫下葉片水勢和植物的存活［30］。保衛(wèi)細胞中脫落酸促進鈣離子通道對 Ca2＋的攝入，Ca2＋作為植物PLD活性的一個調節(jié)因子，能夠激活PLD并促進PLDα與質膜的結合［31］。研究表明，脫落酸可誘導保衛(wèi)細胞中PLD活性的增強［32］。由此可見，PLD可能是Ca2＋濃度發(fā)生變化后作用的底物之一，而該變化響應植物干旱脅迫并使細胞中脫落酸水平增加。因此，PLDα通過參與脫落酸誘導的氣孔運動而正調控植物對水分脅迫的應答反應。ABA、Ca2＋等信號分子在應對不同逆境脅迫響應中的作用方向一致，而PLDα在響應干旱和低溫脅迫應答中的作用截然相反，這源于PLDα在這2種逆境脅迫反應中有著不同的作用機制。在干旱脅迫應答中，PLDα主要通過轉導脫落酸信號來調控氣孔運動進而影響植物的抗旱性。

許多植物在高滲透脅迫環(huán)境下，例如番茄、紫花苜蓿、綠藻和擬南芥脫水葉片中的PLD活性及其產物PA均會增加［33］。高滲透誘導PLD活性增加有可能是對脫落酸的響應，也可能是PLD參與了脫落酸信號傳遞途徑。滲透脅迫與PA水平升高有關［34］。在綠藻、番茄和紫花苜蓿的懸浮細胞系中，在鹽（NaCl）脅迫情況下，PA會迅速積累；采用其他滲透物，如蔗糖、甘露醇等也有類似作用，說明高滲透壓是導致PA快速累積的效應器。當綠藻處于干旱脅迫下時，數分鐘內能特異地誘導PLD表達，同時增強其活性［35－36］。用脫落酸處理植物時則沒有相似現象發(fā)生，表明脫落酸處理和干旱激活不同類型的PLD。外源脫落酸的施加可將干燥條件下果實失水率降低近30%，此時PLD基因的表達也有所增強。

當植物受到干旱脅迫時，為了維持體內充足的水分，脫落酸誘導的氣孔關閉的敏感性將會提高，從而降低蒸騰并減少水分的流失。前期研究表明，PLD在脫落酸介導的信號轉導途徑中也起著重要作用。干旱脅迫會激活PLD，進而促進脫落酸誘導氣孔關閉，減少植株體內的水分流失，從而適應干旱條件。Sang等研究表明，干涉PLD的植株葉片的蒸騰失水率顯著高于野生型對照［33］。孫磊研究表明，PLD的活性增強能顯著降低植物的氣孔導度，減少水分喪失，從而提高抗旱能力［37］。由此可見，PLD主要通過參與調節(jié)水分脅迫條件下的氣孔導度來影響植物的抗旱性。

2.3 機械損傷

機械損傷是造成采后果蔬品質劣變的最嚴重脅迫之一，可使果蔬細胞組織受到嚴重的破壞，引起品質下降，貯藏期縮短。機械損傷能夠改變果蔬的生理代謝過程，使細胞膜受到破壞，導致磷脂降解產生自由脂肪酸和大量的磷脂酸的積累。番木瓜鮮切后，PLD、細胞壁結構蛋白基因表達量增加并伴隨酶活性增加，導致細胞壁軟化加速，進而加快果實軟化［38］。趙宇瑛對黃瓜的研究表明，機械損傷誘導黃瓜的PLD基因表達量增加［39］。

機械損傷會激活PLD并導致磷脂的水解。PLD的激活促進其產物PA的生成，并伴隨游離膽堿水平的升高，表明磷脂酰膽堿是反應的底物。研究表明，抑制擬南芥PLDα的活性可同時減少機械損傷誘導的PA及參與調控許多防御反應的茉莉酸（簡稱JA）的積累［5］。在大豆中，PA能誘導一種機械損傷激活的49 ku分裂素激活的蛋白激酶（簡稱MAPK），通過n－丁醇降低PA的形成可以抑制這種誘導作用，該結果表明PLD的產物PA在MAPK信號轉導中具有信使的功能［40－41］。受到機械損傷刺激后，胞質中的PLD會聚集到膜上，導致膜結合PLD瞬間增加，該過程與磷脂的減少密切相關［42］。進一步研究表明，與膜結合PLD的增加會加速脂質降解。例如，輻射處理后的花椰菜小花會快速引起膜結合PLD活性的增強，并進一步加速細胞膜的降解。蓖麻葉片中膜結合PLD的增加也會影響磷脂降解的速率及葉片的衰老［43］。由此可見，機械傷害引起的PLD活性增強是由膜結合的PLD聚集引起的，其原因可能是PLD與膜的結合會增加其與底物結合的機會，進而促進其作用底物脂質的水解。

PLD活性的增強不是由其mRNA轉錄或蛋白水平的提高造成的，而是PLD蛋白質由胞質向細胞膜轉移造成的［21］。向原生質體培養(yǎng)緩沖液中添加生理濃度的Ca2＋可以增強這種向微粒體的轉移作用，原因之一可能是機械傷害誘導原生質膜中PLD、PLA的協(xié)同激活，進而增加了葉綠體中游離脂肪酸的釋放量、促進茉莉酸的生物合成并激活其下游防御基因。近年來的研究表明，受到機械傷害的蓖麻葉游離亞麻酸的增加與由PLD介導的磷脂水解有關，間接說明PLD與PLA在蓖麻葉在受到機械傷害后的信號轉導過程中起著協(xié)同作用。該結果與前人的研究結果一致，表明多種植物在受到機械傷害的數分鐘內PLA、PLD的作用產物均會增加［33］。

植物受到機械損傷后，其損傷信號可從損傷部位傳遞至未損傷部位，同時誘發(fā)一系列生理生化反應。其中最主要的生理反應之一是細胞膜完整性的損壞，機械損傷后會加快植物膜脂分解代謝，通過增強PLD對產物的水解來響應機械脅迫。有關黃瓜果實機械損傷的研究表明，機械損傷會導致黃瓜細胞膜結合的Ca2＋含量降低，從而促進PLD基因的表達，同時PLD活性的增強，進一步造成其底物PI、PC含量下降和產物PA含量快速上升，并在10 h增長速率達到56.49%［44］。機械損傷會促進植物細胞膜中的Ca2＋向細胞質中的流動，從而誘導PLD基因的表達，提高PLD的活性，最終破壞細胞膜的完整性。此外，黃瓜對機械損傷的響應程度因果實部位的不同而存在一定的差異，采后果蔬的成熟度對機械損傷所引起的PLD的響應程度具有明顯影響，越是成熟的部位PLD變化對損傷越敏感［39，45］。

2.4 低溫及冷害脅迫

低溫條件能夠降低植物細胞的代謝速率，延緩果蔬等植物的成熟衰老過程，然而，某些植物由于對溫度的敏感性，不能適應低溫而容易遭受冷害［46］。冷害信號同樣能夠從損傷組織傳遞到未損傷組織，從而誘發(fā)植物一系列的生理反應。前期研究表明，細胞膜是維持細胞正常代謝和功能的關鍵亞細胞器，而PLD是細胞膜磷脂水解的起始酶類，它既能通過水解細胞膜磷脂調節(jié)膜的結構和功能，也能通過其反應產物如PA、二酰基甘油（簡稱DAG）等參與低溫脅迫條件下細胞的信號轉導［47－48］。黃瓜受到低溫及冷害脅迫時，PLD通過降解細胞膜及其產物參與信號轉導以響應冷害［49］。黃瓜冷害初始反應的首要步驟是激活PLD，隨后PLD活性增強，PLD基因表達與其活性呈現平行關系，且當PLD的轉錄水平達到峰值時，相應的PLD活性大大提高，這時黃瓜對低溫脅迫的感應非常強烈，最終結果就是冷害的形成。黃瓜微粒體膜中與線粒體膜中的PLD基因在接受熱處理時會受到抑制，從而使該基因的表達及活性均有所降低［50－51］。黃瓜果實PLD底物磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰膽堿（PC）含量會在低溫貯藏過程中下降，其產物PA含量則升高，且在冷害開始發(fā)生時PA含量會有一個大幅度升高的過程。PA會破壞膜脂的穩(wěn)定性，其過量積累會直接導致冷害發(fā)生［52］。對桃PLDα基因表達的分析表明，低溫會誘導果實中PLD的表達，因此推測PLD可能作為一種信號分子在果實對低溫、冷害信號的感應與識別中起著重要作用［23］。在植物低溫馴化過程中，會積累大量脯氨酸、可溶性糖等滲透調節(jié)物質，降低細胞滲透勢，以保護細胞免受胞間結冰導致的原生質的脫水脅迫。

3 展望

PLD參與了植物脅迫信號的轉導并在該過程中起著重要作用。細胞膜上的細胞內信號途徑以及磷脂代謝途徑均具有一定程度的復雜多樣性，現階段針對于外界脅迫和傳遞信號過程中的PLD具體功能與途徑并沒有得到確定。采用最新分子生物學方法，深入探究PLD在植物生長和成熟衰老中的作用機制，既能揭示PLD的調控機制及生理功能，又能闡明植物感應和適應環(huán)境因子的機制。但是由于PLD基因表達調控模式及其作用機制的復雜性，PLD的亞型鑒定、純化及其表達模式與組織細胞或生長階段的相關性還未得到闡明，各亞型的調控機制及其參與到其他信號系統(tǒng)的作用方式有待深入探究。通過整合基因編輯技術、生化分析，轉錄組結合蛋白組及脂質代謝組等現代生物技術，將明確各個PLD基因在某一特異信號轉導途徑或者特異細胞過程中的功能，從而系統(tǒng)地揭示PLD在植物中的生物學功能和作用機制，這也將為我們對脂質信號轉導機制及其在逆境或激素的信號傳遞網絡作用中的進一步解析奠定基礎。植物受到逆境脅迫時，會在基因表達、信號轉導、代謝物形成和蛋白表達等多個層次進行響應，隨著高通量測序技術、現代分析技術和生物信息學的發(fā)展，在未來研究中將基因組學、蛋白質組學與代謝組學有機結合，能夠更全面和系統(tǒng)地闡述植物在逆境脅迫下、成熟衰老過程中生理生化過程的關系及相關分子機制，對控制水果、蔬菜等采后品質、探索有效的采后保鮮技術具有重要的科學意義。

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