陳曉翔 張輝 楊璐 熊瑋 黃雄慶

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科（廣州 510080）

對(duì)于終末期腎病，接受腎臟替代治療是不可避免的。相較于其他腎臟替代治療，腎移植（kid?ney transplantation，KTx）無疑是最為有效的治療手段。臨床上，腎缺血再灌注損傷（ischemia reperfu?sion injury，IRI）是KTx中不可避免的病理生理過程。腎IRI的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡以及炎性反應(yīng)等［1］。其中，氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致腎IRI的主要機(jī)制［2］。目前對(duì)于腎IRI尚缺乏有效的治療方式。

高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）治療是指在高于1個(gè)絕對(duì)大氣壓的條件下，吸入高濃度氧或純氧的一種治療方式。目前已被證實(shí)是多種疾病的有效治療方式，包括急性一氧化碳中毒、減壓病、突發(fā)性耳聾、缺血性腦卒中、創(chuàng)傷等［3?4］。同時(shí)高壓氧治療也在一些重要器官和組織（腦、脊髓、心臟）的IRI過程中被證明具有保護(hù)作用［5?6］。

血紅素加氧酶?1（heme oxygenase?1，HO?1）是血紅素轉(zhuǎn)化過程的限速酶，在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要的細(xì)胞保護(hù)作用。研究［7］表明，HO?1過表達(dá)可以減輕腎組織所受的自由基損害。通過化學(xué)或物理手段誘導(dǎo)HO?1表達(dá)增高可能是一種有效的預(yù)防或治療IRI損傷的方法。

目前，高壓氧腎保護(hù)的研究主要集中在腎損傷發(fā)生后［8-9］，而運(yùn)用高壓氧預(yù)處理預(yù)防潛在的腎損害在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。由此，本文擬通過對(duì)受體進(jìn)行高壓氧預(yù)處理，探究高壓氧是否能減輕移植后腎IRI損傷，并探討其與HO?1間的關(guān)系，為臨床運(yùn)用高壓氧改善移植后腎損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只（購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司），6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為3組：（1）對(duì)照組8只（Sham組）；（2）腎移植組8對(duì)（KTx組）；（3）高壓氧預(yù)處理組8對(duì)（HBO+KTx組）。

實(shí)驗(yàn)主要材料如下：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用高壓氧艙（山東煙臺(tái)冰輪高壓氧艙有限公司）；臺(tái)式動(dòng)物手術(shù)顯微鏡（深圳瑞沃德）；全自動(dòng)生化分析儀（日立7020型）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶）；HO?1一抗（CST，USA）。

1.2 腎移植模型制備 4%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg），待大鼠翻正反射消失后，腹正中切口進(jìn)入腹腔。

供體手術(shù)：運(yùn)用顯微鑷仔細(xì)分離左腎，結(jié)扎腎上腺和生殖靜脈。分離主動(dòng)脈、下腔靜脈及左腎動(dòng)靜脈。在腎動(dòng)脈與主動(dòng)脈連接處上方夾閉主動(dòng)脈，近下腔靜脈處剪斷腎靜脈，用4℃肝素鹽水原位灌注移植腎。待腎臟變白或成花斑狀后，在腎動(dòng)脈上下方剪斷腹主動(dòng)脈，近膀胱處剪斷左輸尿管。取出供腎置于4℃肝素鹽水中保存6 h。

受體手術(shù)：進(jìn)入腹腔后立即切除左腎。仔細(xì)分離腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，分別以無創(chuàng)血管夾夾閉移植區(qū)域血管兩端。使用10?0縫線在供體腎靜脈和受體下腔靜脈之間進(jìn)行端側(cè)吻合。同樣在供體主動(dòng)脈與受體主動(dòng)脈之間進(jìn)行端側(cè)吻合。吻合術(shù)成功后，松開血管夾恢復(fù)腎灌注，然后通過輸尿管?膀胱吻合進(jìn)行泌尿道重建。最后切除受體右腎，逐層關(guān)腹。

Sham組開腹后切除右腎，不進(jìn)行腎移植；KTx組實(shí)施腎移植手術(shù)；HBO+KTx組在末次高壓氧預(yù)處理24 h后實(shí)施腎移植手術(shù)。

1.3 高壓氧預(yù)處理方案 將大鼠置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙內(nèi)治療5 d，加壓5 min至0.15 MPa（1.5 ATA），同時(shí)純氧洗艙，之后10 min加壓至0.25 MPa（2.5 ATA），穩(wěn)壓吸氧60 min，減壓15 min。艙內(nèi)氧濃度保持在95%以上。末次高壓氧預(yù)處理后24 h，建立腎移植模型。Sham組、KTx組大鼠僅置于高壓氧艙內(nèi)，而不進(jìn)行加壓。

1.4 取材與檢測(cè) 移植24 h后處死大鼠，由腹主動(dòng)脈采血5～6 mL，3 000 r/min離心10 min取上層血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血Scr、BUN。按試劑盒說明測(cè)定腎組織中SOD、MDA水平。取左腎腹面下半個(gè)腎組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切片后按說明書行HE染色。依據(jù)盲法，將所有組織切片交由同一位病理科人員進(jìn)行Jablonski評(píng)分［10］。腎組織提取總蛋白后按說明書行Western blot檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用one?way ANOVA，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能變化 3組的腎功能指標(biāo)如表1所示，經(jīng)歷腎移植后，血Scr、BUN水平均明顯升高，若經(jīng)高壓氧預(yù)處理，腎損害有所減輕。

表1 各組血清Scr、BUN水平比較Tab.1 Serum creatinine and BUN level of each group x±s

2.2 腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo) 如圖1所示，高壓氧預(yù)處理能顯著降低移植腎組織MDA水平。HBO+KTx組MDA水平明顯低于KTx組（0.48±0.05vs.0.60±0.11，P＜0.05）。Sham組與HBO+KTx組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.43±0.04vs.0.48±0.05，P＞0.05）。同時(shí)，高壓氧預(yù)處理可顯著提高組織中SOD水平。與KTx組相比，HBO+KTx組中SOD活性明顯升高（152.3±13.75vs.132.0±7.54，P＜0.05）。

2.3 腎組織形態(tài)學(xué)改變 HE染色可見，Sham組表現(xiàn)為正常腎組織（圖2A）；KTx組可觀察到腎小管組織壞死、細(xì)胞質(zhì)空泡化等（圖2B）；而在經(jīng)高壓氧預(yù)處理后的組織中，腎小管壞死的比例明顯減少（圖2C）。HBO+KTx組Jablonski評(píng)分明顯低于KTx組。

2.4 腎組織HO?1表達(dá)情況 Western blot結(jié)果提示，高壓氧預(yù)處理后，HBO+KTx組中的HO?1含量明顯高于KTx組。同時(shí)，與Sham組相比，其余兩組中的HO?1含量均明顯升高（圖3）。

圖1 各組移植腎組織中SOD（A）、MDA（B）水平Fig.1 The graft tissue SOD（A）and MDA（B）level of each group

圖2 腎移植24 h后腎組織HE染色（放大倍數(shù)×200）Fig.2 HE staining of graft at 24 h after kidney transplantation

圖3 移植腎組織中HO-1蛋白含量Fig.3 HO?1 level in graft tissues of each group

3 討論

本研究旨在探討高壓氧預(yù)處理在腎移植中的保護(hù)作用。各項(xiàng)結(jié)果表明，對(duì)受體進(jìn)行為期1周的高壓氧預(yù)處理，能夠有效減輕腎移植所致的組織損傷和細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，高壓氧預(yù)處理能夠減輕組織中MDA含量并提高抗氧化酶的活性。與此同時(shí)，高壓氧預(yù)處理還能增加腎組織中HO?1水平，進(jìn)而起到腎保護(hù)作用。

盡管IRI所致腎損傷的機(jī)制目前仍不十分明確，目前認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、過多的活性氧分子產(chǎn)生以及炎癥因子是主要原因［11］，且活性氧（reactive oxygen species，ROS）在IRI的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用［12］。自由基能引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致血管通透性增高、間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和中性粒細(xì)胞激活等。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)，腎移植術(shù)后腎組織中MDA含量顯著增高（圖1），提示移植后腎損傷與腎組織脂質(zhì)過氧化有關(guān)。而經(jīng)高壓氧預(yù)處理后，MDA明顯降低。由此可推測(cè)，高壓氧預(yù)處理能夠減輕氧化應(yīng)激所致的脂質(zhì)過氧化。該作用可能是高壓氧預(yù)處理能誘導(dǎo)SOD等抗氧化酶的活性增高，清除了IRI發(fā)生時(shí)產(chǎn)生的過多的ROS，進(jìn)而減輕了脂質(zhì)過氧化損傷。

1992年，NATH 等［13］首次發(fā)現(xiàn)急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）能誘導(dǎo)HO?1表達(dá)，且具有保護(hù)作用。當(dāng)給予大鼠HO抑制劑SnPP以增加腎組織血紅素含量后，腎功能損害嚴(yán)重且腎小管上皮細(xì)胞廣泛受損［7］。近年來，HULL等［14］也證實(shí)HO?1缺陷小鼠的腎臟更易受到缺血損害。這些研究均表明HO?1在腎IRI具有決定性作用。目前對(duì)于HO?1在氧化應(yīng)激損傷中保護(hù)作用的機(jī)制尚不明確。其中一種解釋是，受損細(xì)胞會(huì)釋放出游離血紅素，并通過兩種途徑引起細(xì)胞損傷：（1）直接誘導(dǎo)細(xì)胞損傷；（2）產(chǎn)生有害的羥基自由基。而HO?1能夠催化游離血紅素降解，起到細(xì)胞保護(hù)作用。在肺、心、腦等組織的損傷模型中，高壓氧治療已被證實(shí)能夠上調(diào)組織中HO?1的表達(dá)，進(jìn)而起到保護(hù)作用［5］。本研究也發(fā)現(xiàn)，雖然在KTx組中HO?1表達(dá)增多（圖3），但仍無法應(yīng)對(duì)腎IRI損傷，表現(xiàn)為腎功能受損和腎小管損傷。而在高壓氧預(yù)處理后的HBO+KTx組中，HO?1的含量顯著增多，受到腎IRI的影響更小，腎功能受損及腎小管壞死程度較輕。

綜上所述，在大鼠同系異體KTx模型中，高壓氧預(yù)處理能夠誘導(dǎo)移植腎的缺血耐受，其機(jī)制可能是：高壓氧預(yù)處理能夠減輕移植腎組織脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)抗氧化酶活性；同時(shí)上調(diào)組織中HO?1的表達(dá)，提高HO?1含量，從而起到腎保護(hù)作用。

KTx所伴隨的移植腎損傷的原因是多方面的，本研究?jī)H對(duì)腎缺血再灌注這一病理生理過程進(jìn)行探討。高壓氧預(yù)處理能夠減輕移植腎損傷，但其與HO?1的關(guān)系及相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍有待下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明。

參考文獻(xiàn)

［1］ ELTZSCHIG H K，ECKLE T.Ischemia and reperfusion—from mechanism to translation［J］.Nat Med，2011，17（11）：1391?1401.

［2］ MALEK M，NEMATBAKHSH M.Renal ischemia/reperfusion in?jury；from pathophysiology to treatment［J］.J Renal Inj Prev，2015，4（2）：20?27.

［3］ BENNETT M H，WEIBEL S，WASIAK J，et al.Hyperbaric oxy?gen therapy for acute ischaemic stroke［J］.Cochrane Database Syst Rev，2014（11）：D4954.

［4］ ESKES A，VERMEULEN H，LUCAS C，et al.Hyperbaric oxy?gen therapy for treating acute surgical and traumatic wounds［J］.Cochrane Database Syst Rev，2013（12）：D8059.

［5］ YIN X，WANG X，F(xiàn)AN Z，et al.Hyperbaric Oxygen Precondi?tioning Attenuates Myocardium Ischemia?Reperfusion Injury Through Upregulation of Heme Oxygenase 1 Expression：PI3K/Akt/Nrf2 Pathway Involved［J］.J Cardiovasc Pharmacol Ther，2015，20（4）：428?438.

［6］ MATCHETT G A，MARTIN R D，ZHANG J H.Hyperbaric oxy?gen therapy and cerebral ischemia：neuroprotective mechanisms［J］.Neurolog Res，2009，31（2）：114?121.

［7］ SHIMIZU H，TAKAHASHI T，SUZUKI T，et al.Protective ef?fect of heme oxygenase induction in ischemic acute renal failure［J］.Crit Care Med，2000，28（3）：809?817.

［8］ SOLMAZGUL E，UZUN G，CERMIK H，et al.Hyperbaric oxy?gen therapy attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats［J］.Urologia Internationalis，2007，78（1）：82?85.

［9］ RAMALHO R J，OLIVEIRA P，CAVAGLIERI R C，et al.Hy?perbaric Oxygen Therapy Induces Kidney Protection in an Isch?emia/Reperfusion Model in Rats［J］.Transplant Proceed，2012，44（15）：2333?2336.

［10］ JABLONSKI P，HOWDEN B O，RAE D A，et al.An experimen?tal model for assessment of renal recovery from warm ischemia［J］.Transplantation，1983，35（3）：198?204.

［11］ 任冰霜，雷艷，黃梁滸.腎臟缺血再灌注損傷的分子機(jī)制［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（10）：1710?1712.

［12］ ANNUK M，ZILMER M，LIND L，et al.Oxidative stress and en?dothelial function in chronic renal failure［J］.J Am Soc Nephrol，2001，12（12）：2747?2752.

［13］ NATH K A，BALLA G，VERCELLOTTI G M，et al.Induction of heme oxygenase is a rapid，protective response in rhabdomyol?ysis in the rat［J］.J Clin Invest，1992，90（1）：267?270.

［14］ HULL T D，KAMAL A I，BODDU R，et al.Heme Oxygenase?1 Regulates Myeloid Cell Trafficking in AKI［J］.J Am Soc Nephrol，2015，26（9）：2139?2151.