李青春 邢怡橋 李岱

1湖北科技學(xué)院眼科教研室（湖北咸寧437100）；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心（武漢430060）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，也是全球最常見的致盲性眼病之一。近年來研究［1?2］證實(shí)，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是DR的關(guān)鍵組成部分，對(duì)其凋亡的干預(yù)，能夠抑制或延緩DR的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡與Bcl?2和Bax等相關(guān)［3］。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種多酚類化合物，具有廣泛的生物和藥理活性。有研究表明［4］Res具有抗凋亡作用，但作用于DR的機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬通過觀察Res對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Bcl?2和Bax表達(dá)的影響，探討Res防治DR的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 Res和STZ均購自美國sigma公司，Bax、Bcl?2 單克隆抗體均購自美國 Cell Signal?ing Technology公司，SP、DAB試劑盒均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物的造模及分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠35只由湖北科技學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［許可證號(hào)：SYXK（鄂）2013?0071）］提供，平均體質(zhì)量（250±10）g。隨機(jī)選取其中10只大鼠作為正常對(duì)照組（Control組），注射等量的檸檬酸緩沖液，而另外25只參照付書華等［5］的方法制備糖尿病模型。最終20只大鼠血糖達(dá)到要求，被作為糖尿病模型大鼠。用隨機(jī)數(shù)字表法將20只糖尿病模型大鼠分為糖尿病組（DM組）和Res藥物干預(yù)組（DM+Res組），每組10只。DM+Res組每日按20 mg/（kg·d）量［6］給予Res灌胃1次（將Res溶于0.5%羧甲基纖維素制成混懸液）；Control組及DM病組均給予容量與體質(zhì)量相同的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃12周后處死，并取其眼球。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果判定 各組大鼠眼球行常規(guī)固定、包埋、切片、HE染色后每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野（400×）觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化并拍照。在距離鋸齒緣附近500～600 μm處隨機(jī)選取3個(gè)點(diǎn)測(cè)定視網(wǎng)膜全層及內(nèi)核層、外核層的厚度［7］。免疫組織化學(xué)法按SP試劑盒操作步驟實(shí)施，胞內(nèi)有棕黃色顆粒的為陽性細(xì)胞。每組取5張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，選取相同的放大倍數(shù)（400×）和光強(qiáng)度對(duì)切片上免疫組織化學(xué)陽性染色進(jìn)行測(cè)定。Image?Pro Plus6.0軟件下分析照片，得出陽性的累積光密度值（IOD），Bcl?2和Bax表達(dá)量與IOD值成正比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Res對(duì)視網(wǎng)膜厚度的影響 與Control組相比，DM組大鼠視網(wǎng)膜總厚度、內(nèi)核層及外核層厚度均顯著減少（P＜0.01，圖1A）；與DM組相比，DM+Res組大鼠視網(wǎng)膜總厚度、內(nèi)核層及外核層厚度均顯著增厚（P ＜ 0.05，圖1B、C、D）。Control組與DM+Res組大鼠視網(wǎng)膜總厚度、內(nèi)核層及外核層厚度相比差異無顯著性（P＞0.05）。

圖1 Res對(duì)視網(wǎng)膜形態(tài)和視網(wǎng)膜厚度的影響Fig.1 Effect of Res on the morphology and thickness of retinas in diabetic rats

2.2 Res對(duì)視網(wǎng)膜Bcl?2和Bax表達(dá)的影響 Bcl?2和Bax免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀，位于細(xì)胞漿內(nèi)，主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層。見圖2A。與Control組相比，DM組Bcl?2表達(dá)減弱（P ＜ 0.01），Bax表達(dá)增強(qiáng)（P ＜ 0.01），Bcl?2/Bax比值下降（P ＜0.01）；與DM組相比，DM+Res組Bcl?2表達(dá)增強(qiáng)（P ＜0.01），Bax表達(dá)減弱（P ＜0.01），Bcl?2/Bax比值上升（P ＜ 0.01）。見圖2B、C、D。Control組與DM+Res組大鼠視網(wǎng)膜Bcl?2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl?2/Bax比值差異無顯著性（P＞0.05）。

圖2 Res對(duì)視網(wǎng)膜Bax和Bcl?2表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Res on Bax and Bcl?2 expression in retinas of the diabetic rats

3 討論

早在20世紀(jì)90年代末，視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性病變的概念就被提出。近年來研究［8］表明視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷在DR發(fā)生發(fā)展中愈發(fā)突出，其主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜厚度變薄及凋亡細(xì)胞數(shù)增加等。Res是一種多酚類化合物，具有廣泛的生物和藥理活性，前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)白內(nèi)障、青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性等眼部疾病具有防治作用［9］。本研究發(fā)現(xiàn)Res可顯著抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜總厚度、內(nèi)核層和外核層厚度變?。磺遗c正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜厚度差異無顯著性，表明Res可通過減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的病理變化，延緩DR的進(jìn)程。

有研究［10］表明視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷是由多種凋亡相關(guān)基因參與的調(diào)控過程。其中負(fù)責(zé)編碼的Bcl?2蛋白，能阻止多種信號(hào)通路阻斷細(xì)胞凋亡、延長細(xì)胞的存活期；而Bax是一種能促使或介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線粒體膜蛋白［11］，一定條件下兩者可相互結(jié)合成二聚體。當(dāng)Bcl?2表達(dá)過量時(shí)，便形成Bcl?2/Bcl?2同源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞受到保護(hù)；而當(dāng)Bax過度表達(dá)時(shí)，不僅可與Bcl?2形成Bcl?2/Bax異源二聚體，拮抗Bcl?2抑制凋亡的作用，還可與Bax形成Bax/Bax同源二聚體，激活Caspases介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［12］。Bcl?2/Bax的比值可反映 Bcl?2和Bax在細(xì)胞凋亡中的效應(yīng)，兩者的平衡能保證細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，比值的變化是細(xì)胞存活或凋亡的決定因素［13］。當(dāng) Bcl?2/Bax比值升高時(shí)，其效應(yīng)是抑制細(xì)胞凋亡，反之，則是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

有研究證實(shí)Res可通過增加Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ的活性，抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡［14］。本研究通過檢測(cè)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中Bcl?2及Bax蛋白強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜中的Bcl?2蛋白表達(dá)下降而Bax蛋白表達(dá)顯著增多，Bcl?2/Bax的比值明顯減小，與很多學(xué)者關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果相似［15?16］，說明Bcl?2及Bax參與了實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡。而采用Res干預(yù)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Bcl?2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)減少，Bcl?2/Bax的比值升高，且與正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜Bcl?2 及 Bax表達(dá)相當(dāng)，表明 Res可通過上調(diào) Bcl?2的表達(dá)和下調(diào)Bax的表達(dá)，調(diào)整Bcl?2/Bax比值趨于正常化而發(fā)揮抗凋亡的作用。

綜上所述，Res能減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的病理變化，并通過上調(diào)Bcl?2的表達(dá)及下調(diào)Bax的表達(dá)，提高Bcl?2/Bax比值，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞凋亡，從而延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展。本研究僅探討了Res對(duì)Bcl?2和Bax的影響，Res是否能通過其他作用機(jī)制對(duì)DR起防治作用，將是今后的研究方向。

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