趙振寧，趙寶勰

(白銀市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 甘肅 白銀 730900)

隨著全球性氣候變暖，干旱缺水已經(jīng)成為發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要限制因素。我國有45%的國土面積處于西部干旱或者半干旱地區(qū)，該地區(qū)降水量少、年內(nèi)分配不均、空氣干燥、地表蒸發(fā)量大，給主要農(nóng)作物生產(chǎn)帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)[1]。大豆(Glycinemax(L.) Merr)是我國重要的糧油兼用作物，營養(yǎng)價值高，是人類食物中植物蛋白質(zhì)的主要來源。同時，大豆也是耗水量較大的作物，生育期內(nèi)水分虧缺影響大豆正常生長發(fā)育及產(chǎn)量形成。因此，篩選大豆抗旱種質(zhì)資源、培育抗旱節(jié)水品種被認為是發(fā)展干旱半干旱地區(qū)大豆生產(chǎn)的有效措施。

國內(nèi)學(xué)者們在大豆不同生長發(fā)育時期抗旱性評價方面做了大量的工作，并篩選出一批抗旱種質(zhì)資源[2-7]。種子萌發(fā)是植物整個生活史中的關(guān)鍵階段，也是進行抗旱性研究的重要時期，萌發(fā)期遭遇干旱脅迫會影響出苗，最終造成產(chǎn)量損失。目前，萌發(fā)期抗旱性評價主要采用室內(nèi)PEG溶液模擬干旱法，該方法具有周期短、容量大、重復(fù)性強以及受其它環(huán)境因子影響小等優(yōu)點[8]，已廣泛應(yīng)用于小麥(TriticumaestivumL.)[9-10]、玉米(ZeamaysL.)[11-12]、水稻(OryzasativaL.)[13-14]及大豆[15-16]等主要農(nóng)作物萌發(fā)期抗旱性評價研究中。王利彬等[17]研究發(fā)現(xiàn)利用15% PEG-6000對大豆品種萌發(fā)期抗旱性鑒定指標影響明顯，并在該濃度下將91份大豆種質(zhì)資源劃分為耐旱、較耐旱、中間型、干旱較敏感型以及干旱敏感型5大類；肖佳雷等[5]采用20% PEG-6000對78份大豆種質(zhì)進行萌發(fā)期抗旱鑒定，篩選得到黑河53、合豐45、合豐48、綏農(nóng)22及綏農(nóng)30等5份抗旱種質(zhì)；舒英杰等[18]以抗旱性不同的3個大豆品種為材料進行大豆發(fā)芽期耐旱性鑒定，認為室內(nèi)采用PEG-6000浸種法模擬干旱脅迫鑒定大豆發(fā)芽期耐旱性的適宜濃度為20%～25%。可以看出，上述研究中所使用的PEG濃度(滲透壓)不盡一致，即便在同一作物中也有所不同。因此，篩選出穩(wěn)定、可靠的PEG處理濃度、建立切實可行的評價體系是進行萌發(fā)期抗旱評價的首要工作。

本試驗通過分析不同濃度PEG-6000對3個大豆品種萌發(fā)相關(guān)指標的影響，確定了用于抗旱評價的最佳濃度，并在該濃度下研究了PEG-6000模擬干旱脅迫對不同大豆品種生理生化指標的影響，最后采用隸屬函數(shù)法對3個品種的抗旱性進行綜合評價，以期為大豆種質(zhì)萌發(fā)期抗旱性鑒定評價體系建立以及抗旱新品種選育提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料培養(yǎng)與處理

大豆品種黃豆(野生種)、晉豆19、鄭9007種子由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺-甘肅子平臺提供。挑選大小均勻一致、籽粒飽滿的干凈大豆種子，用0.5%次氯酸鈉溶液消毒10 min，其間不斷晃動，蒸餾水沖洗三遍后用無菌濾紙吸干，播于底部覆有雙層無菌濾紙的直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，每皿30粒，分別加入12%、14%、16%、18%及20%的PEG-6000溶液25 mL，并以無菌蒸餾水作為對照，置于溫度為25℃、濕度為(65±2)%的智能人工氣候培養(yǎng)箱(RTOP-150B，浙江托普儀器有限公司)中進行萌發(fā)試驗。每個處理設(shè)3次重復(fù)，每天稱重并補充蒸發(fā)的蒸餾水以維持溶液滲透勢的恒定。

1.2 測定方法

1.2.1 生長指標的測定 胚芽長度超過種子長度時視為發(fā)芽，第3 d開始每天統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)。發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽試驗期間全部正常發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%，發(fā)芽勢(%)=(第4 d正常發(fā)芽的種子粒數(shù)/供試種子數(shù))×100%。萌發(fā)試驗第7 d，每個培養(yǎng)皿隨機抽取10株測量胚根長。

1.2.2 生理指標的測定 分別取經(jīng)18%的PEG-6000溶液和蒸餾水培養(yǎng)7 d的胚根，蒸餾水沖洗干凈后吸干水分用于測定SOD、POD及CAT活性、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸及丙二醛含量。其中，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑光化還原法[19]，以抑制NBT光化還原50%所需酶量為1個酶活單位(U·g-1FW)；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[19]，以每分鐘OD值變化0.01為1個酶活單位(U·min-1·g-1FW)；過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性測定采用紫外分光光度計法[20]，以每分鐘OD值變化0.01為1個酶活性單位(U·min-1·g-1FW)；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法測定[20]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法測定[20]；脯氨酸含量的測定采用Troll等方法[21]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測定[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013和Origin8.5軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析及最小顯著差異性檢驗(Duncan’s新復(fù)極差法，P<0.05)。參照裴帥帥等[23]的方法進行基于隸屬函數(shù)法的綜合評價，首先計算各指標的相對值(PEG處理與正常條件下的比值)，然后計算其隸屬函數(shù)值，并求其平均值作為抗旱性評價的依據(jù)。隸屬函數(shù)計算公式為：

U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

其中，Xi為某一指標第i個品種的相對值；Xmin為某一指標的最小值；Xmax為某一指標的最大值。如果某一指標與抗旱性為正相關(guān)，用(1)式計算，反之，則用(2)式。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PEG處理對3個大豆品種種子萌發(fā)相關(guān)指標的影響

隨著PEG濃度的不斷增加，3個大豆品種的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率以及相對胚根長都呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(表1)。在PEG濃度12%～14%之間時，3個大豆品種的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對胚根長均無顯著差異(P>0.05)，當PEG濃度增加到16%時，3個品種的相對發(fā)芽勢和相對胚根長仍無顯著差異(P>0.05)，但黃豆和鄭9007的相對發(fā)芽率顯著高于晉豆19(P<0.05)。當濃度在18%～20%之間時，3個品種之間的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率以及相對胚根長均差異顯著(P<0.05)。由此可見，在18% PEG模擬干旱脅迫下，3個品種的萌發(fā)相關(guān)指標的差異明顯。

表1 不同濃度PEG-6000處理對3個大豆品種萌發(fā)及胚根生長的影響

注：不同小寫字母表示各品種間的差異達到顯著水平(P<0.05)，下同。

Note: Different small letters meant significant difference among treatments at 0.05 level. The same below.

2.2 PEG模擬干旱脅迫對3個大豆品種抗氧化酶活性的影響

SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其中SOD可以催化超氧陰離子(O2·)轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)，POD和CAT將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，它們在植物體清除過量ROS的生物過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[24]。從圖1中可以看出，在18% PEG-6000處理使3個大豆品種的SOD、POD及CAT活性發(fā)生了顯著變化，在正常環(huán)境(CK)下，3個品種胚根SOD、POD及CAT活性均處于較低水平，18% PEG-6000處理下，3個品種(黃豆、晉豆19和鄭9007)胚根SOD活性分別上升為CK的5.41、3.54和4.30倍，POD活性上升為CK的2.13、1.58和1.52倍，CAT活性上升為CK的2.64、2.41和1.98倍。通過多重比較發(fā)現(xiàn)，18% PEG-6000處理下3個品種胚根中SOD活性大小依次為黃豆>鄭9007>晉豆19，其中黃豆與晉豆19和鄭9007相比差異顯著(P<0.05)，而晉豆19和鄭9007相比差異不顯著(P>0.05)；3個品種POD和CAT活性大小依次為黃豆>晉豆19>鄭9007，其中，黃豆與鄭9007和晉豆19相比差異顯著(P<0.05)，而鄭9007和晉豆19相比差異不顯著(P>0.05)。由以上結(jié)果可知，盡管18% PEG-6000使3個品種SOD、POD及CAT活性發(fā)生了明顯變化，且黃豆在干旱脅迫下3種抗氧化酶活性的增長倍數(shù)明顯高于晉豆19和鄭9007，說明黃豆與晉豆19和鄭9007相比可能具有更強的抗旱能力。

2.3 PEG模擬干旱脅迫對3個大豆品種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

植物體內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以降低細胞的滲透勢，保護細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，在干旱逆境條件下這類物質(zhì)可以提高植物的抗逆能力，也是評價植物抗旱性的重要生化指標[25-26]。由圖2可知，3個大豆品種在正常條件(CK)下的可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量相對穩(wěn)定，品種間的差異不明顯，在18% PEG處理下，3個大豆品種(黃豆、晉豆19和鄭9007)可溶性糖含量分別上升為CK的2.84、2.60和2.56倍，可溶性蛋白含量上升為CK的2.13、1.42和1.10倍，脯氨酸含量上升為CK的10.98、6.74和8.90倍。相比而言，在18% PEG-6000處理下，3個品種可溶性糖、可溶性蛋白的積累量從大到小依次為黃豆>晉豆19>鄭9007，脯氨酸的積累量從大到小依次為黃豆>鄭9007>晉豆19，可以看出，在干旱脅迫下，黃豆與晉豆19、鄭9007相比積累了更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可能具有較強的抗旱性。

圖1 PEG脅迫對三個大豆品種萌發(fā)期SOD、POD及CAT活性的影響

Fig.1 Effect of PEG stress on activities of SOD, POD and CAT of three soybean varieties during germination

2.4 PEG模擬干旱脅迫對3個大豆品種丙二醛含量的影響

在正常生長環(huán)境中，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當植物遭受脅迫環(huán)境時這種平衡會被打破，導(dǎo)致H2O2、超氧陰離子(O2·)等活性氧(ROS)大量積累，并造成膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA大量生成[27]。從圖3中可以看出，正常條件下3個品種的MDA含量處于較低水平，但品種之間存在顯著差異，在18% PEG-6000處理下，3個品種MDA含量分別升高為CK的1.59、3.24倍和2.85倍，脅迫下的MDA含量從小到大依次為黃豆<晉豆19<鄭9007，可見在干旱脅迫下，黃豆的膜脂受傷害程度明顯小于晉豆19和鄭9007。

圖2 PEG脅迫對三個大豆品種萌發(fā)期滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

圖3 PEG脅迫對三個大豆品種萌發(fā)期丙二醛含量的影響

Fig.3 Effect of PEG stress on contents of MDA of three soybean varieties during germination

2.5 PEG模擬干旱脅迫下3個大豆品種耐受性指標隸屬函數(shù)值及綜合評價

抗旱性是復(fù)雜的數(shù)量遺傳性狀，單一指標評價品種抗旱能力存在片面性，通過計算各指標的相對值，進而計算隸屬值，取某一品種各指標的隸屬值的平均值進行綜合抗旱評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃豆、晉豆19和鄭9007的抗旱性強弱依次為黃豆>鄭9007>晉豆19，由此可見，大豆野生種黃豆的抗旱能力遠遠大于育成品種晉豆19和鄭9007，利用野生種黃豆進行大豆抗旱遺傳改良具有可行性。

表2 3個大豆品種耐旱指標隸屬函數(shù)值及綜合評價

3 討 論

干旱是影響作物生長發(fā)育的常見非生物脅迫因素，因干旱造成的作物產(chǎn)量損失等于其它脅迫造成的產(chǎn)量損失之和[7]。在全球氣候變化的背景下，研究大豆的抗旱性鑒定評價技術(shù)，對于篩選抗旱種質(zhì)、培育節(jié)水品種以獲高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)有重要意義。相比而言，提高大豆在萌發(fā)期的抗旱能力可以有效提高大豆在播種后的出苗率，可以有效提高干旱半干旱地區(qū)的大豆產(chǎn)量。目前，關(guān)于大豆萌發(fā)期抗旱性評價研究多使用室內(nèi)PEG溶液模擬干旱脅迫，存在鑒定評價指標和PEG濃度不統(tǒng)一的問題。本研究中18% PEG-6000溶液處理能夠區(qū)分3個品種之間的差異，可作為大豆萌發(fā)期抗旱性評價的PEG處理濃度。

大豆抗旱性的遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，依靠單一的萌發(fā)指標難以評價其抗旱能力，采用多個形態(tài)及生理指標進行綜合評價可反映品種真實的抗旱水平[7]。SOD、POD及CAT在植物抵御干旱逆境反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在18% PEG-6000干旱脅迫下，3個大豆品種SOD、POD及CAT活性與CK相比明顯升高，同時，黃豆SOD、POD和CAT活性明顯高于晉豆19和鄭9007(P<0.05)，但晉豆19和鄭9007之間差異不顯著(P>0.05)，說明大豆野生種黃豆相比而言可能具有較強的抗旱能力，這與綜合評價結(jié)果一致。滲透調(diào)節(jié)也是植物應(yīng)對干旱脅迫的重要機制，干旱脅迫下，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加有助于維持細胞膨壓，將水勢維持在一定的水平，使細胞的正常生理代謝得以正常進行，脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對細胞內(nèi)的ROS有直接的清除作用[29-30]。本研究中，干旱脅迫使3個品種的可溶性糖、可溶性蛋白以及脯氨酸含量均明顯增加，這與許興[31]、李樹華[32]等的研究結(jié)果一致。在3個大豆品種中，黃豆的可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量明顯高于晉豆19和鄭9007，說明黃豆的抗旱性較強。MDA是細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低在一定程度上反映了植物在干旱脅迫下的受傷害程度，3個品種的MDA含量從小到大為黃豆<晉豆19<鄭9007，說明黃豆在干旱脅迫下的受傷害程度較小，可能具有較強的抗旱能力。

隸屬函數(shù)分析提供了一條在多指標測定基礎(chǔ)上對材料特性進行綜合評價的途徑，將它應(yīng)用于抗旱育種的選擇，可以大大提高抗旱性篩選的可靠性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物抗逆性綜合評價[33-36]。通過對3個品種的萌發(fā)指標及生理生化指標進行隸屬函數(shù)分析，最終確定了3個品種抗旱能力為黃豆>鄭9007>晉豆19，黃豆的綜合隸屬函數(shù)值為0.997，而晉豆19和鄭9007分別為0.176和0.219，可見大豆野生種黃豆的抗旱能力遠遠高于其它2個品種，可以利用這一種質(zhì)資源進行大豆抗旱遺傳改良，培育抗旱節(jié)水的大豆新品種。

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