張丹丹,張麗梅,沈菊培,旺 姆

1 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 城市與區(qū)域國家重點實驗室,北京 100085 2 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3 西藏農(nóng)牧學(xué)院,林芝 860000

土壤微生物數(shù)量和種類繁多,每克土壤中微生物的數(shù)量可達(dá)幾十億,上萬個物種[1]。微生物是土壤最具有生命力的組分,驅(qū)動著土壤中幾乎所有已知的生物反應(yīng)過程,在有機(jī)物質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)、污染物轉(zhuǎn)化與分解、溫室氣體產(chǎn)生和消減等過程中起著重要作用,對土壤肥力形成、土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能維持乃至全球變化都具有重要影響[1- 3]。鑒于土壤微生物的重要功能及其對外界環(huán)境變化的敏感響應(yīng),土壤微生物常被用作評價環(huán)境變化的重要指標(biāo)[3- 4]。

全球氣候變化早已成為不爭的事實,據(jù)IPCC(2007)報告預(yù)測到21世紀(jì)末,全球地表溫度可能升高1.1—6.4℃[5]。高寒生態(tài)系統(tǒng)及干旱半干旱生態(tài)系統(tǒng)作為全球變化的敏感區(qū)域,主要分布在北極,北部森林,青藏高原和高山苔原等地,其氣候變暖速度高于地球平均水平;此外,氣候變化通過改變降水格局而加速高寒生態(tài)系統(tǒng)退化,影響土壤微生物的群落組成和生物多樣性[6]。因此,高寒生態(tài)系統(tǒng)對氣候變化的響應(yīng)與反饋不僅影響著當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng),也將對全球生態(tài)系統(tǒng)及人類生活產(chǎn)生巨大影響。近年來,人們對高寒生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物展開了大量的研究。Bryant等對美國科羅拉多州落基山脈(海拔2400—3600m)細(xì)菌多樣性的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌類群豐富度、系統(tǒng)發(fā)育多樣性均隨海拔高度上升而降低[7];Margesin等發(fā)現(xiàn)高山(海拔2300—2530m)和亞高山(海拔1500—1900m)土壤微生物活性隨海拔增加而降低,且微生物群落組成隨海拔增加變化,一些嗜冷細(xì)菌、真菌和革蘭氏陰性細(xì)菌主要在高海拔地區(qū)出現(xiàn)[8]。Shen等對我國長白山地區(qū)的研究也發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌群落隨海拔明顯變化,細(xì)菌群落組成及優(yōu)勢門的相對豐度與土壤pH顯著相關(guān)[9]?？梢姾０蜗嚓P(guān)因素在很大程度上影響著微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)。

青藏高原是世界上海拔最高的高原,地勢險峻多變,地形復(fù)雜,素有“世界屋脊”和“地球第三極”之稱,是北半球氣候變化的啟張器和調(diào)節(jié)器,不僅直接驅(qū)動中國東部和西南部氣候的變化,而且對北半球具有巨大的影響,甚至對全球的氣候變化,也具有明顯的敏感性、超前性和調(diào)節(jié)性[10]。青藏高原板塊構(gòu)造隆升形成了其獨特的自然地理環(huán)境：高寒,輻射強(qiáng),日照時間長,缺氧,養(yǎng)分濃度低,氣溫隨高度和緯度的升高而降低。因此,表層土壤微生物群落在對抗上述極端環(huán)境過程中可能會形成特有的生存適應(yīng)能力和群落組成差異。此外,由于青藏高原對全球氣候的敏感性,全球變暖和CO2濃度升高可能會對地下微生物產(chǎn)生復(fù)雜的影響[11]。如蘆曉飛利用克隆測序技術(shù)對西藏米拉山高寒草甸土壤(海拔3600m)細(xì)菌和古菌群落多樣性發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在著豐富的特殊微生物資源,但是由于受到氣候變化和人類活動影響,退化草甸土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[12]。彭岳林等對藏北高原不同海拔(海拔4584—4956m)草地植物叢枝菌根(AM)真菌種群多樣性的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)Glomus屬真菌為最優(yōu)勢屬,且草地類型、海拔高度和土壤pH值是影響AM真菌生態(tài)分布的重要因子[13]。李超男等對貢嘎山海拔梯度上(海拔1800—4100m)土壤甲烷氧化菌的研究發(fā)現(xiàn)土壤理化性質(zhì)和氣候變化綜合作用是造成甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化的主要因素[14]。

以上研究雖然都是針對青藏高原地區(qū)微生物群落開展的,但是主要集中在低海拔地區(qū),尤其在珠峰永久雪線以上的研究非常少。鑒于青藏高原在全球變化中的特殊地位和作用,深入研究不同海拔梯度下細(xì)菌和真菌物種多樣性及群落組成沿海拔高度的變化及其規(guī)律,對于理解全球氣候變化對青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的影響和及其響應(yīng)機(jī)制具有重要意義。此外,高寒生態(tài)系統(tǒng)因其獨特的自然氣候條件,賦予了一些土壤微生物的獨特優(yōu)勢,也是微生物資源的潛在寶庫,研究青藏高原珠穆朗瑪峰高原土壤微生物豐度和群落組成為合理開發(fā)利用高寒生態(tài)系統(tǒng)微生物資源提供參考。以往研究中,發(fā)現(xiàn)珠穆朗瑪峰高山土壤中(海拔4000—6550m)氨氧化細(xì)菌和古菌的豐度和群落組成隨海拔梯度發(fā)生明顯變化,尤其在雪線附近發(fā)生顯著轉(zhuǎn)變[15],但對于土壤中細(xì)菌和真菌群落整體組成情況不清楚。本研究利用活菌計數(shù)法(CFU)、實時定量PCR(real-time PCR)技術(shù),并結(jié)合磷脂脂肪酸PLFA分析法,變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)和克隆測序方法研究了青藏高原珠穆朗瑪峰坡底和永久雪線以上高海拔(4000—6550m)地區(qū)土壤細(xì)菌和真菌群落的組成特征,以期為理解全球變化對青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的影響以及發(fā)掘高寒地區(qū)土壤微生物資源提供基礎(chǔ)信息。

1 材料和方法

1.1 土壤樣品采集

本研究土壤樣品為中國科學(xué)院第四次珠穆朗瑪峰遠(yuǎn)征期間(2005年4月至6月)采集自珠峰北部斜坡。除3個樣品(M1—M3)取自西藏日喀則地區(qū)的農(nóng)田土壤外(28°82′N,29°28′E;海拔4000m左右,年均溫6.3℃),其余樣品(M4—M12)均采自珠峰北坡不同海拔高度(28°01′570″—28°08′385″N,86°51′533″—86°56′686″E)的裸地,海拔高度分別為5350,5400,5700,5850,6000,6150,6300,6450,6550m。每個采樣點均取5個重復(fù)次樣點,采樣時用鏟子移除大石頭和積雪層后采集0—10cm深度的土壤或細(xì)砂礫,混合后于移動冰箱運回實驗室,部分樣品保存于4℃用于活菌計數(shù)和土壤理化性質(zhì)分析,其余樣品保存到-20℃冰箱用于DNA提取和分析。

1.2 磷脂脂肪酸(PLFA)分析

磷脂脂肪酸的提取方法和分析依照Bardgett等人描述的方法[16]。操作步驟如下：稱取4g土壤樣品于特氟龍管內(nèi),用氯仿-甲醇-磷酸緩沖液(1∶2∶0.8)提取總脂類,通過離心分離得到的磷脂脂肪酸經(jīng)50℃堿性甲酯化后利用氣體色譜Agilent 6820測定土壤微生物磷脂脂肪酸的含量,以標(biāo)準(zhǔn)定性C11到C20混合細(xì)菌酸甲酯為外源標(biāo)準(zhǔn)(Bacterial Acid Methyl Esters CP Mix, Matreya Inc.)。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)實驗,脂肪酸的命名方法如Frostegard等人[17]描述。細(xì)菌生物量通過3-OH 12:0,14:0, 2-OH 14:0,i- 15:0,和a- 15:0,15:0,i- 16:0,16:1ω9c,16:0,i- 17:0,17:0cy和10Me18:0的脂肪酸進(jìn)行估算[18- 21],真菌生物量用18:2ω9,12,18:1ω9c,18:1ω9t進(jìn)行估算[17- 20]。此外,革蘭氏陽性細(xì)菌通過i- 15:0、a- 15:0、i- 16:0,i- 17:0和10Me18:0估算,革蘭氏陰性細(xì)菌利用3-OH 12:0,14:0, 2-OH 14:0,15:0,16:1ω9c,16:0和17:0cy計算[22- 24]。

1.3 活菌計數(shù)

樣品活菌計數(shù)采用稀釋平板法進(jìn)行,為盡可能模仿原生境寡營養(yǎng)條件培養(yǎng),細(xì)菌計數(shù)以10倍稀釋的PGY培養(yǎng)基(PGY：蛋白胨10g,酵母膏5g,葡萄糖1g,蒸餾水1L,pH=7.4),真菌計數(shù)以含50mg/L硫酸鏈霉素的10倍稀釋的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA：馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,蒸餾水1L,pH自然)培養(yǎng)基進(jìn)行。操作過程為：稱取土壤或砂礫樣品10g,加入90mL無菌水后振蕩30min,取1mL土壤懸浮液轉(zhuǎn)移到裝有9mL無菌水試管中,充分混合,并進(jìn)行系列稀釋。吸取不同稀釋程度的菌懸液各0.1mL至培養(yǎng)皿中,涂布均勻。在正式進(jìn)行計數(shù)培養(yǎng)前,選擇了少量樣品進(jìn)行溫度影響試驗,發(fā)現(xiàn)在4℃培養(yǎng)一個月后細(xì)菌和真菌的(Colony forming units,CFUs)數(shù)比22℃培養(yǎng)明顯少,故在進(jìn)行正式計數(shù)培養(yǎng)時將平板置于22℃黑暗培養(yǎng)7d和14d后進(jìn)行菌落計數(shù),計算可培養(yǎng)微生物的數(shù)量。

1.4 DNA提取和PCR變性梯度凝膠電泳(DGGE)

土壤總DNA提取采用FastDNA SPIN Kit for Soil 試劑盒(Q·BIOgene, Inc., Carlsbad, CA)進(jìn)行,所有操作依照產(chǎn)品說明書進(jìn)行,鮮土稱重0.8—1.0g,破碎速度設(shè)定為5.5m/s,破碎時間20s。提取的DNA樣品在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測后使用微量分光光度計Nanodrop? ND- 1000測定濃度和純度(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)。

以引物f954-gc和r1369[25]和引物NS1和Fung GC[26](表1)分別對細(xì)菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增在PTC- 200 thermal cycler (MJ-Research, Waltham, MA) 進(jìn)行,擴(kuò)增程序如表1。PCR反應(yīng)混合物的體積為50μL,包括1 × PCR buffer, 2mmol/L MgCl2, 400nM正反向引物濃度, 250μM dNTP, 2.5U ExTaqDNA polymerase (TaKaRa Bio Inc. Otsu, Shiga, Japan),0.4mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和DNA模板10ng。所獲得的PCR產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺膠中進(jìn)行DGGE電泳,細(xì)菌所用的變性膠濃度范圍是40%—60%,真菌的變性膠濃度范圍為10%—30%。電泳在DCode Universal Detection System Instrument (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)進(jìn)行。電泳條件為120v,60℃恒溫條件,7h。依照操作說明將凝膠在1:10000 SYBR Gold 染料 (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, USA)染色30min后利用凝膠呈像儀(G:BOX HR,Syngene, Frederick, USA)進(jìn)行呈像掃描,并用Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)軟件分析結(jié)果。

對DGGE圖譜中清晰條帶進(jìn)行切膠回收,并將膠條轉(zhuǎn)移到50μL 10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中,反復(fù)凍融3次以上。取上清液2μL用無GC夾子原引物再次擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物以膠回收試劑盒(TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan)切膠純化后,連接到pGEM-T Easy Vector上(Promega, Madison, USA)試劑盒連接載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109感受態(tài)細(xì)胞(JM109)(TaKaRa, Japan),涂布到含有氨芐青霉素(Ampicillin)/IPTG/X-Gal的LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)16—18h。隨機(jī)選取若干白色克隆子,采用菌體直接擴(kuò)增方式,用pGEM-T Easy Vector通用引物T7/SP6擴(kuò)增外源插入片段。每個條帶挑選3個陽性克隆子測序,利用DNAMAN 6.0.3.48 (Lynnon Biosoft, USA)進(jìn)行序列分析,并把所得正確長度的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列對比,下載最相似菌種序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。然后采用Clustal W和Mega 4.0軟件建立Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹,系統(tǒng)發(fā)育樹各分支置信度由自舉分析方法(Bootstrap)檢驗,重復(fù)1000次。

1.5 熒光定量PCR分析(real-time PCR)

利用實時熒光定量PCR對土壤中的細(xì)菌和真菌豐度進(jìn)行定量分析,所用引物和探針具體信息詳見表1。細(xì)菌熒光定量PCR分析采用探針法：使用TaqMan探針TM1389(5′-CTTGTACACACCGCCCGTC- 3′)(Takara Bio Inc. Otsu, Shiga, Japan),定量引物分別為BACT1369F(5′-CGGTGAATACGTTCYCGG- 3′)/PROK1541R(5′-AAGGAGGTGATCCRGCCGCA- 3′)[27];真菌擴(kuò)增使用引物ITS1f(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3′)/5.8s(5′-CGCTGCGTTCTTCATCG- 3′)[28]。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為25μL,細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增使用Premix Ex TaqTM(TaKaRa),真菌ITS區(qū)擴(kuò)增采用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa),反應(yīng)條件和引物濃度參見表1。已提取的DNA經(jīng)5或10倍稀釋后作為模版DNA添加到混合體系中,其終濃度為1—10ng,同時加入0.4mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)用于減少雜質(zhì)對PCR反應(yīng)的抑制作用。每個樣品做3個平行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用quantity one軟件對DGGE膠圖像中條帶的位置和亮度進(jìn)行處理,依據(jù)數(shù)字化結(jié)果,計算多樣性指數(shù)。采用canonical correspondence analyses (CCAs)分析環(huán)境和土壤變量對微生物種間群落結(jié)構(gòu)的影響,在CANOCO 4.5軟件中進(jìn)行。CFU數(shù)據(jù)和基因拷貝數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行ANOVA分析。本研究中的統(tǒng)計分析在SPSS 13.0軟件中進(jìn)行,其中多組數(shù)據(jù)間的方差分析采用單因素方差分析(Duncan,P<0.05);相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。

細(xì)菌和真菌rRNA基因序列GenBank號為：(遞交中)

表1 本研究中用到的引物,探針和PCR條件

2 結(jié)果

2.1 土壤的基本理化性質(zhì)

土壤的基本理化性質(zhì)如我們之前的研究報道[15]。海拔高度在4000m左右的農(nóng)田土壤(M1—M3)pH值為8.6—8.7,海拔高于5000m高度的樣品(M4—M12)pH值在9.0至9.1之間(圖1A)。

圖1 青藏高原珠穆朗瑪峰不同海拔梯度土壤樣品的理化性質(zhì)及其細(xì)菌和真菌的豐度變化Fig.1 Physicochemical properties and abundance changes of bacteria and fungi of soil samples along different altitudes from Mount Everest, on the Tibetan Plateau

在低海拔土壤樣品中(M1—M3,4000m),有機(jī)質(zhì)含量范圍在8.4—12.6g/kg干土之間,土壤全氮在0.51—0.66g/kg干土之間。而高海拔土壤樣品(M4—M12,≥5350m)土壤有機(jī)質(zhì)和全氮明顯低于低海拔土壤樣品,其有機(jī)質(zhì)含量為2.9—6.3g/kg干土,全氮為0.06—0.21g/kg干土(圖1)。

2.2 細(xì)菌/真菌活菌計數(shù)和16S rRNA基因豐度

利用10倍稀釋的PGY和PDA培養(yǎng)基對細(xì)菌和真菌進(jìn)行的平板計數(shù)分析結(jié)果如圖1所示。樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量隨海拔增加而降低,在低海拔農(nóng)田土壤樣品(M1—M3)中達(dá)每克干土含(1.53—5.68)×107CFU/g,高海拔土壤/砂礫樣品(M4—M12,≥5350m)(每克干重含7.36×104—8.83×106CFU/g)高1到2個數(shù)量級。所有土壤中可培養(yǎng)真菌的數(shù)量均較細(xì)菌低2個數(shù)量級,但變化趨勢與細(xì)菌相似,在低海拔農(nóng)田土壤中為每克干土(2.21—6.09)×105CFU/g之間,高海拔樣品(M4—M12,≥5350m)中為1.67×103—1.16×104CFU/g干土。相關(guān)分析結(jié)果表明,細(xì)菌和真菌的CFU均與海拔高度呈負(fù)相關(guān)(r1=-0.797,r2=-0.656,P<0.05),與全氮含量呈顯著正相關(guān)(r1=0.534,r2=0.565,P<0.05)。

利用實時熒光定量PCR技術(shù)對細(xì)菌的16S rRNA基因豐度和真菌ITS豐度進(jìn)行的分析結(jié)果表明,細(xì)菌16S rRNA基因豐度隨海拔高度增加而降低,在低海拔農(nóng)田土壤樣品(M1—M3)達(dá)4.13×109—1.09×1010拷貝數(shù)/g干土,高于高海拔樣品(M4—M12,≥5350m)(8.82×107—5.63×109拷貝數(shù)/g干土)1到2個數(shù)量級;所有土壤真菌ITS豐度較細(xì)菌低1個數(shù)量級,但其變化趨勢與細(xì)菌相類似,在低海拔土壤樣品中豐度范圍在6.27×108拷貝數(shù)/g干土至1.20×109拷貝數(shù)/g干土之間,在高海拔土壤樣品中豐度在4.63×106—2.77×108拷貝數(shù)/g干土之間變化(圖1)。與活菌計數(shù)結(jié)果類似,細(xì)菌的rRNA基因和真菌ITS的豐度與土壤海拔高度呈顯著負(fù)相關(guān)(r1=-0.481,r2=-0.543,P<0.05),與土壤有機(jī)質(zhì)(r1=0.606,r2=0.636,P<0.05)和全氮(r1=0.667,r2=0.697,P<0.05)呈正相關(guān)(表2)。

表2 土壤基本屬性與多種微生物多樣性相關(guān)分析

2.3 細(xì)菌和真菌磷脂脂肪酸含量和組分

磷脂脂肪酸分析結(jié)果表明,不同海拔梯度樣品的磷脂脂肪酸總量(total PLFA)在20.86和177.58nmol/g之間,其中細(xì)菌來源的磷脂脂肪酸含量在8.87—108.42nmol/g之間,真菌來源的為7.82—58.16nmol/g,無論是總的PLFA含量,還是細(xì)菌和真菌的PLFA含量均隨著海拔增加而降低(圖1,圖2),與海拔呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),與有機(jī)質(zhì)和全氮含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(表2)。

在供試的12個土壤樣品中,共檢測到15種C12—C18的PLFAs組分,所有樣品中均檢測到飽和脂肪酸(3-OH 12:0,14:0, 2-OH 14:0,i- 15:0, a- 15:0,15:0,i- 16:0, 16:0,i- 17:0和10Me18:0)、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸。隨著海拔高度增加,樣品中PLFA種類和數(shù)量逐漸降低,其中低海拔土壤樣品(M1—M3)含有15個單體PLFAs,M4和M5其次,含有12個單體PLFAs,而在海拔高度高于5700m的樣品中(M6—M12),僅含有7種PLFAs,但這7種PLFAs(2-OH 14:0, 16:1ω9c, 16:0, 18:0,18:2ω9,12, 18:1ω9c, 18:1ω9t)在所有海拔高度樣品中均有分布,其中2-OH 14:0, 16:1ω9c, 16:0代表革蘭氏陰性細(xì)菌的特征脂肪酸[22-23],18:2ω9,12, 18:1ω9c和18:1ω9t代表真菌的特征脂肪酸[22-23]。而代表革蘭氏陽性細(xì)菌的i- 15:0,i- 17:0和代表革蘭氏陰性細(xì)菌的17:0△在海拔大于5350m的樣品(M4—M5)中未檢測到,代表革蘭氏陰性細(xì)菌的3-OH 12:0,14:0,15:0和代表革蘭氏陽性細(xì)菌的i- 15:0和i- 16:0的組份在海拔≥5700m的樣品(M6—M12)中均未檢測到(圖2),表明這些微生物類群不能適應(yīng)于高海拔環(huán)境。

圖2 青藏高原珠穆朗瑪峰不同海拔梯度樣品中的PLFA種類分布Fig.2 The content of PLFA composition in samples from Mount Everest, on the Tibetan PlateauM1—M3代表低海拔農(nóng)田土壤樣品(4000m),M4—M12代表高海拔土壤樣品(≥5350m)

對磷脂脂肪酸PLFAs組成與環(huán)境變量進(jìn)行的典范對應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis)結(jié)果顯示,具有相似海拔高度的樣品聚集在一起,其中,低海拔農(nóng)田土壤樣品(M1—M3)和高海拔土壤樣品(M4—M12)沿y軸分開,而來自最高海拔的樣品(M10—M12)與海拔稍低的樣品(M4—M9)沿x軸被分開,x軸和y軸分別解釋了87.2%和7.4%的變異。此外,海拔高度、土壤有機(jī)質(zhì)和全氮對PLFAs的組成影響顯著(P<0.05)(圖3)。

圖3 微生物磷脂脂肪酸群落組成與環(huán)境變量的典范對應(yīng)分析(CCA) Fig.3 Canonical correspondence analysis of PLFA composition and environmental variablesM1—M3代表低海拔農(nóng)田土壤樣品(4000m),M4—M12代表高海拔土壤樣品(≥5350m)

2.4 不同海拔梯度樣品細(xì)菌和真菌群落組成

對細(xì)菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因的變性梯度凝膠電泳(DGGE)后,利用quantity one 軟件對DGGE膠圖像中條帶的位置和亮度進(jìn)行提取后,進(jìn)行UPGMA聚類分析結(jié)果顯示,細(xì)菌UPGMA聚類分布圖中低海拔農(nóng)田土樣(M1—M3)聚成一個小支,與高海拔樣品明顯分開(圖4),表明低海拔農(nóng)田土壤和高海拔樣品中細(xì)菌群落組成明顯不同。對于真菌來說,則只觀察到高海拔樣品(M10—M12)單獨聚集(圖5)?？偟膩碚f,低海拔農(nóng)田土壤樣品(M1—M3)DGGE圖譜更相似,而在高海拔土壤樣品(M4—M12,≥5350m)中,細(xì)菌和真菌條帶數(shù)量均在M5樣品中最高。

選擇細(xì)菌DGGE圖譜中代表低海拔土壤樣品M1和代表高海拔土壤樣品M4、M5、M6和M9清晰條帶進(jìn)行克隆測序并構(gòu)建細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在M1樣品中檢測到變形菌綱(Proteobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria)和放線菌綱(Actinobacteria),M4樣品中檢測到變形菌綱(Proteobacteria),M5中檢測到變形菌綱(Proteobacteria),芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes),藍(lán)藻菌綱(Cyanobacteria),異常球菌屬(Deinococcus-Thermus),厚壁菌門(Fimicutes),裝甲菌門(Armatimonadetes),擬桿菌綱(Bacteroidetes)和放線菌綱(Actinobacteria),M6中檢測到放線菌綱(Actinobacteria),M9中檢測到酸桿菌綱(Acidobacteria),其中5個樣品中處于同一位置的DGGE條帶測序結(jié)果一致。從圖6可以看到,所有土樣中均含有區(qū)域1(條帶24)和區(qū)域3(條帶10)的條帶,測序結(jié)果顯示這兩個區(qū)域的條帶代表變形菌綱(Proteobacteria),說明變形菌是青藏高原地區(qū)的優(yōu)勢菌群;區(qū)域2條帶6和25代表芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)僅分布在高海拔樣品中;此外,區(qū)域4條帶3代表的放線菌綱(Actinobacteria)主要分布在低海拔樣品中,在高海拔樣品中較為少見。由于真菌DGGE圖譜中不同海拔高度土壤樣品清晰條帶較少,將所有清晰條帶克隆測序并構(gòu)建了真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7),結(jié)果顯示真菌序列分布在子囊菌門(Ascomycetes)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和其他真核生物(Cercozoa)三個簇中;結(jié)合DGGE圖譜可以看出區(qū)域1條帶4,5和30代表Cercozoa僅分布在高海拔樣品中,而區(qū)域2條帶17,20代表子囊菌門(Ascomycetes)在所有土樣中均有分布,說明子囊菌門(Ascomycetes)為青藏高原地區(qū)的優(yōu)勢菌群(圖7)。

圖4 青藏高原珠穆朗瑪峰不同海拔梯度下土壤樣品中細(xì)菌DGGE圖譜及其UPGMA聚類分布Fig.4 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) profiles and the UPGMA dendrogram of bacteria in soils from Mount Everest, on the Tibetan Plateau

圖5 青藏高原珠穆朗瑪峰不同海拔梯度下土壤樣品中真菌DGGE圖譜及其UPGMA聚類分布Fig.5 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) profiles and the UPGMA dendrogram of fungi in soils from Mount Everest, on the Tibetan Plateau

圖6 細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of bacterial 16S rRNA gene in soils from Mount Everest, on the Tibetan Plateau

圖7 真菌ITS基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic relationships among fungal sequences in soils from Mount Everest, on the Tibetan Plateau

3 討論

3.1 細(xì)菌和真菌數(shù)量隨海拔增加的變化特征

本研究中,用10倍稀釋的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基進(jìn)行的活菌計數(shù)結(jié)果表明低海拔土壤樣品細(xì)菌CFU數(shù)(1.53—5.68)×107CFU/g明顯高于高海拔樣品(7.36×104—8.83×106CFU/g)。類似地,真菌CFU分布情況與細(xì)菌一致,低海拔土壤樣品CFU(2.21—6.09×105CFU/g)較高海拔樣品高1—2個數(shù)量級(1.67×103—1.16×104CFU/g)。利用熒光定量PCR技術(shù)對細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS基因豐度的分析結(jié)果與活菌和真菌計數(shù)結(jié)果一致,低海拔土壤樣品細(xì)菌和真菌豐度明顯高于高海拔地區(qū)土壤樣品1到2個數(shù)量級。相關(guān)分析結(jié)果表明無論細(xì)菌和真菌的CFU數(shù)量,還是16S rRNA和ITS基因拷貝數(shù)均與全氮和有機(jī)質(zhì)顯著正相關(guān),與海拔高度顯著負(fù)相關(guān)性。此外,細(xì)菌和真菌PLFA量隨海拔增加而降低,與土壤海拔呈負(fù)相關(guān),與有機(jī)質(zhì)和全氮呈顯著正相關(guān)。隨海拔高度增加,土壤養(yǎng)分、氧氣、溫度降低,輻射增加,這些都可能是導(dǎo)致微生物生長代謝減弱、生物量隨海拔增加而減少的決定性因素。結(jié)果與以往在青藏高原腹地海拔高度在3400—4300m的三江源自然保護(hù)區(qū)高寒草原的研究結(jié)果一致,說明即使在嚴(yán)酷的生存環(huán)境下,青藏高原仍存有豐富的微生物類群,且高海拔高寒等極端環(huán)境明顯抑制了微生物的活動從而導(dǎo)致其微生物量逐漸降低[31- 32]。此外,CFU和熒光定量PCR結(jié)果顯示青藏高原珠穆朗瑪峰土壤樣品中細(xì)菌豐度明顯高于真菌豐度一個數(shù)量級,且細(xì)菌和真菌變化趨勢呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.909,P<0.05),這與任佐華等人對青藏高原高寒草地土壤(海拔3400—4200m)微生物活性和微生物量的研究結(jié)果相類似[31-33],導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是細(xì)菌和真菌占據(jù)的生態(tài)位相似,在青藏高原極端生存環(huán)境下,細(xì)菌由于個體小,繁殖快在資源競爭中處于優(yōu)勢[34- 36]。

3.2 不同海拔梯度上細(xì)菌和真菌的群落組成特征

磷脂脂肪酸(PLFA)常用來表征復(fù)雜環(huán)境中具有活性的微生物群落組成。在12個供試樣品中共檢測到15種PLFAs,包括代表革蘭氏陽性細(xì)菌的脂肪酸組份i- 15:0、a- 15:0、i- 16:0和i- 17:0,代表革蘭氏陰性細(xì)菌的組份3-OH 12:0,14:0, 2-OH 14:0,15:0,16:1ω9c,16:0,17:0△和10Me 18:0,和代表真菌的組份18:2ω9,12,18:1ω9c,18:1ω9t。無論是細(xì)菌還是真菌的脂肪酸組分均隨海拔增加而減少,主要表現(xiàn)為海拔高度大于5350m(雪線)時,表征革蘭氏陽性細(xì)菌的脂肪酸(a- 15:0和i- 17:0)未被檢測到,當(dāng)海拔高度增加到5700m以上時,表征革蘭氏陽性細(xì)菌的所有脂肪酸(i- 15:0、a- 15:0、i- 16:0和i- 17:0)均未被檢測到。同時,表征革蘭氏陰性細(xì)菌的脂肪酸17:0△在海拔高度大于5350m時未被檢測到,當(dāng)海拔增加到5400m時,3-OH12:0和14:0也未被檢測到,但2-OH 14:0,16:1ω9c和16:0脂肪酸在全部樣品中均有分布,說明青藏高原珠穆朗瑪峰土壤中細(xì)菌多樣性隨海拔增加而降低,且革蘭氏陽性細(xì)菌對海拔高度的變化較革蘭氏陰性細(xì)菌更為敏感,可能的原因是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)簡單,只含有90%肽聚糖和10%磷壁酸,其對抗外界環(huán)境變化的緩沖能力較弱,而革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁較為復(fù)雜,不僅含有肽聚糖,其細(xì)胞壁外還有由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干種蛋白質(zhì)組成的外膜能夠有效的阻止或減緩有害物質(zhì)或惡劣環(huán)境對細(xì)胞的迫害,從而保護(hù)細(xì)胞的正常生長代謝[37]。此外,表征真菌的PLFAs(18:2ω9,12,18:1ω9c,18:1ω9t)在所有土壤樣品中均有分布,說明海拔高度增加未能影響真菌在高山土壤的分布,與蔡曉布等在西藏高原草地生態(tài)系統(tǒng)中觀察到的結(jié)果一致[38],這可能是由于真菌在生理上更耐受低溫,以及其通過產(chǎn)生孢子抵御不良環(huán)境等所致。該結(jié)果與DGGE圖譜的UPGMA聚類分析結(jié)果相一致,再次表明不同海拔高度能夠顯著影響細(xì)菌群落組成,但對真菌群落變化沒有顯著影響。

對微生物磷脂脂肪酸PLFA組成與環(huán)境變量的典范對應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis)結(jié)果表明海拔高度、土壤有機(jī)質(zhì)和全氮是決定極端環(huán)境下高山土壤微生物群落的組成和多樣性的主要因子。與對微生物量的影響相似,隨著海拔上升,植被逐漸退化,土壤養(yǎng)分減少,不僅影響土壤微生物數(shù)量,也會對土壤中微生物類群造成極大的危害,導(dǎo)致土壤微生物多樣性降低[32]。與此同時,高山溫度會隨海拔升高而降低,Lipson等人針對不同季節(jié)和海拔梯度下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與溫度的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn),低海拔地區(qū)微生物群落對溫度較高海拔地區(qū)更為敏感[8,39]。

對細(xì)菌DGGE主要條帶的克隆測序分析結(jié)果顯示,變形菌綱(Proteobacteria)在低海拔和高海拔樣品中均有分布,說明變形菌是青藏高原土壤的優(yōu)勢菌群;芽單胞菌僅出現(xiàn)在了高海拔樣品中,這可能與芽單胞菌易受環(huán)境濕度的影響有關(guān)[40]。DeBruyn等通過對南極旱地土壤、高山干旱土壤和高山苔原等13個不同類型土壤中芽單胞菌豐度和群落組成的研究發(fā)現(xiàn),芽單胞菌相對豐度與水分負(fù)相關(guān),芽單胞菌適宜在較為干燥的環(huán)境中生存[41]。本研究中低海拔樣品主要分布在日喀則地區(qū),其降水含量較高海拔樣品豐沛,相對較高的降水量會使低海拔樣品的芽單胞菌代謝受到抑制,而高海拔相對干燥的環(huán)境促進(jìn)了芽單胞菌的生長繁殖,使芽單胞菌成為高海拔樣品中的優(yōu)勢菌群。放線菌綱(Actinobacteria)主要分布在低海拔樣品中出現(xiàn),較少在高海拔樣品中發(fā)現(xiàn),說明放線菌隨著海拔高度的增加而減少,這與以往對西藏土壤放線菌研究結(jié)果相似,即放線菌數(shù)量隨海拔升高,凍結(jié)期增長顯著減少[42]。

對真菌DGGE主要條帶的克隆測序結(jié)果顯示子囊菌門(Ascomycetes)廣泛分布在低海拔和高海拔樣品中,在4000m海拔樣品中也檢測到部分擔(dān)子菌門(Basidiomycota),但子囊菌門(Ascomycetes)是主要優(yōu)勢菌群。此外,利用真菌引物NS1/Fung GC還回收到部分與絲足蟲類(Cercozoa)原生生物如Cryothecomonas,Lecythium等高度相似的序列,但這些序列僅分布在高海拔冰雪覆蓋的樣品中,表明這些序列所代表的生物具有較強(qiáng)的耐寒能力,與以往的研究相類似。如Cryothecomonas最早在南極海冰和冰緣區(qū)被發(fā)現(xiàn)[43- 44],并相繼在冰芯,沉積物和水柱[45- 48]中被發(fā)現(xiàn)。此外,Thaler等利用特異性熒光原位雜交技術(shù)對北極和亞北極海域中的Cryothecomonas研究發(fā)現(xiàn)Cryothecomonas豐度與冰和融雪量顯著正相關(guān),說明Cryothecomonas可以作為北極冰柱融化的敏感指標(biāo)[48]。雖然本研究選擇DGGE圖譜測序的代表條帶可能不會完全反映土壤中微生物群落結(jié)構(gòu),但至少代表了樣品中優(yōu)勢微生物類群的變化特征。

4 結(jié)論

本文綜合采用平板活菌計數(shù),定量PCR,PLFA和DGGE技術(shù)探討了青藏高原珠穆朗瑪峰北坡從坡底牧草和農(nóng)業(yè)土壤,到海拔6550m高度的高山土壤或風(fēng)化不完全的砂礫樣品中微生物的生物量和群落組成特征。結(jié)果表明受海拔依賴的相關(guān)因子,如養(yǎng)分(有機(jī)質(zhì)、總氮)、溫度等的影響,無論是活性細(xì)菌和真菌的CFU數(shù),細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS基因豐度,還是PLFA所代表的微生物量和物種多樣性均隨海拔升高明顯降低。此外,PLFA中代表革蘭氏陽性細(xì)菌的組分在高于5350m以上的樣品中缺失,而代表革蘭氏陰性細(xì)菌的部分組分和真菌組分在所有樣品中都有分布,表明革蘭氏陽性細(xì)菌比革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌對海拔梯度變化更為敏感,該結(jié)果與不同樣品中細(xì)菌DGGE指紋圖譜隨海拔高度聚集成簇,而真菌DGGE指紋圖譜隨海拔高度變化無明顯聚集的結(jié)果相一致,表明海拔高度顯著影響細(xì)菌群落組成,但對真菌群落變化沒有顯著影響。此外,對細(xì)菌和真菌DGGE主要條帶的回收測序分析結(jié)果顯示變形菌綱是珠峰不同海拔高度土壤/砂礫樣品中的優(yōu)勢菌群,芽單胞菌是高海拔樣品中的優(yōu)勢菌群,而放線菌主要分布在低海拔樣品中;真菌以子囊菌門為優(yōu)勢菌群。此外,利用真菌的引物還在高海拔冰雪覆蓋樣品回收到絲足蟲類原生生物,代表了冰雪覆蓋樣品中所特有真核生物類群。這些結(jié)果為認(rèn)識全球變化對高寒區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的影響以及發(fā)掘高寒地區(qū)土壤微生物資源提供了重要信息。

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