薛 欣，李玉梅，李海玉，陳 冰，張立石，馬雅鑾

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，由各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為主要特征的臨床病理綜合征。目前公認(rèn)的NAFLD發(fā)病機(jī)制為“二次打擊”學(xué)說(shuō)[1]?！岸未驌簟睂W(xué)說(shuō)表明，炎癥反應(yīng)在NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起很重要的作用。近年來(lái)的研究表明，脂肪肝組織中存在著慢性炎癥。其特點(diǎn)一是與炎癥反應(yīng)相關(guān)的脂肪因子(adipokine)合成異常[2]；二是急性期反應(yīng)物增多，如C-反應(yīng)蛋白(C response protein，CRP)[3]等；三是炎癥信號(hào)網(wǎng)絡(luò)激活、過(guò)度表達(dá)促炎性和炎性介質(zhì)，如白細(xì)胞介素(inferleukin，IL)- 6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、細(xì)胞間黏附分子(intercellular cell adhesion molecule，ICAM)-1、單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein， MCP)-1等[4]；四是肝巨噬細(xì)胞(Kuppfer細(xì)胞)聚集、極化與NAFLD有密切關(guān)系[5-6]。

脾虛生痰是脂肪肝形成的重要病機(jī)之一。臨床應(yīng)用健脾化痰法治療脂肪肝具有較好療效[7-9]。健脾化痰湯(二陳湯與四君子湯的和方)具有健脾、化痰之功效。本研究以高脂飼料聯(lián)合脂肪乳灌胃復(fù)制大鼠脂肪肝模型，觀察健脾化痰湯對(duì)血清C-反應(yīng)蛋白、肝組織炎癥因子的影響，從巨噬細(xì)胞極性的角度探討炎癥在健脾化痰湯防治肝細(xì)胞脂肪變性中的作用。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD 雄性大鼠40只，體質(zhì)量(200±20 g)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK(軍)2012-0004)，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(為清潔級(jí)動(dòng)物室)。

1．2 藥物和試劑

易善復(fù)多烯磷脂酰膽堿膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字H20059 010)購(gòu)于賽諾菲安萬(wàn)特制藥有限公司；脂肪乳(20%豬油，10%膽固醇，2%膽鹽，1%丙基硫氧嘧啶)，其中豬油自備，膽固醇(批號(hào)20130626)、膽鹽(批號(hào)20120410)、丙基硫氧嘧啶(批號(hào)20130307)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C反應(yīng)蛋白(CRP) ELISA試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；RNA 提取試劑盒購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針GAPDH、MCP1、干擾素γ(IFNγ)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)由美國(guó)Life Technology公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)ABI公司；7500 Real-time PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1．3 藥物制備

健脾化痰湯的組成：黨參9 g，白術(shù)9 g，茯苓9 g，甘草6 g，法半夏15 g，陳皮15 g，生姜3 g，烏梅1枚。所有藥材均購(gòu)自北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司，水煎劑濃縮至折合原藥材濃度1.0 g/ml(相當(dāng)于70 kg成人臨床等效劑量的8倍)。易善復(fù)(多烯磷脂酰膽堿)溶液制備：以相當(dāng)于70 kg成人臨床等效劑量8倍，用蒸餾水溶解制成易善復(fù)溶液。脂肪乳的制備：將20%豬油、10%膽固醇、2%膽鹽、1%丙基硫氧嘧啶按比例攪勻。

1．4 方法

1．4．1 分組、造模及給藥 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體質(zhì)量均衡和隨機(jī)原則分為正常對(duì)照組、模型組、健脾化痰湯組和易善復(fù)組各10只。正常組大鼠給予維持期飼料飼養(yǎng)、自由飲水，模型組和給藥組大鼠均按0.5 ml/只/d的量灌胃脂肪乳,連續(xù)造模8周。自造模之日起，健脾化痰湯組給予含生藥1.0 g/ml的濃縮液灌胃，易善復(fù)組作為陽(yáng)性對(duì)照藥，以相當(dāng)于70 kg體質(zhì)量成人臨床用藥量8倍的量灌胃，各給藥組按1 ml/100 g體質(zhì)量灌胃，每日1次，連續(xù)給藥8周。正常組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。各組大鼠于造模給藥結(jié)束后處死，留取肝組織標(biāo)本及下腔靜脈取血。

1．4．2 計(jì)算肝臟指數(shù) 經(jīng)左心室插管注入冰生理鹽水對(duì)肝臟灌流，瀝干水分稱肝重。計(jì)算肝臟指數(shù)=肝濕重/體質(zhì)量×100%。

1．4．3 血清生化測(cè)定 下腔靜脈取血10 ml，室溫靜止，4000 r/min 離心20 min，迅速分離血清， -80 ℃冰箱保存。用全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus AU400)檢測(cè)肝功能指標(biāo)，如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量；檢測(cè)血脂指標(biāo)，如總膽固醇(TC)、總甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量；檢測(cè)血清中C-反應(yīng)蛋白(CRP)含量，測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1．4．4 實(shí)時(shí)定量PCR(探針?lè)?檢測(cè)肝組織炎癥因子、脂肪因子基因表達(dá) 采用RNeasy Plus Micro Kit提取RNA并溶于20ulRNAase-free H2O中，測(cè)定RNA純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄采用High Capacity RNA-to-cDNA 試劑盒,總體系為20ul，其中RNA溶液10μl，反應(yīng)條件25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min；4 ℃冷卻，RT-PCR采用Gene Expression Master Mix 試劑盒及GAPDH、MCP1、IFNγ、IL-4、IL-10探針和ABI 7500型基因擴(kuò)增儀，總體系20 μl，其中10 μl Master Mix，8 μl ddH2O，1μl探針，1μl cDNA 模板，擴(kuò)增條件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 預(yù)變性 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃退火延伸60 s，共60個(gè)循環(huán)。以內(nèi)源性GAPDH作參照，使用ABI SDS 7500 software 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟指數(shù)及血清肝功能、CRP比較

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)明顯升高(P<0.01)，而健脾化痰組(P<0.05)、易善復(fù)組(P<0.05)肝臟指數(shù)較模型組降低。

表1 大鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST比較

注：與對(duì)照組比較:aaP<0.01；與模型組比較:bP<0.05，bbP<0.01

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST含量略有增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；健脾化痰組、易善復(fù)組ALT、AST含量較模型組均有下降趨勢(shì)，健脾化痰組的ALT(P<0.01)、AST(P<0.05)及易善復(fù)組的AST(P<0.05)下降較為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示雖然模型組大鼠并無(wú)明顯肝功能改變，健脾化痰湯、易善復(fù)亦可對(duì)肝功能有不同程度改善作用。

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中CRP含量明顯增高(P<0.01)，可達(dá)對(duì)照組的2.5倍；CRP作為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，是一種非特異性的炎癥標(biāo)志物，與急慢性炎癥性疾病密切相關(guān)。模型組CRP含量的增高提示機(jī)體處于炎癥狀態(tài)。健脾化痰組、易善復(fù)組CRP含量較模型組均下降明顯(P<0.05)，提示給藥組可不同程度地抑制炎癥狀態(tài)。

2.2 各組大鼠血脂含量的變化

表2顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TC、LDL含量明顯增高(P<0.01)；TG含量略有增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HDL含量雖僅有下降趨勢(shì)，但HDL/TC明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，提示模型組大鼠存在嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝紊亂。與模型組大鼠比較，健脾化痰組TG含量明顯降低(P<0.05)、HDL/TC明顯提高(P<0.05)，TC、LDL含量?jī)H有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能與灌胃脂肪乳中含有膽固醇有關(guān)，提示健脾化痰湯可明顯抑制由高脂飼料聯(lián)合脂肪乳灌胃引起大鼠血脂水平的增高。

表2 大鼠血清中TC、TG、LDL、HDL和HDL/TC含量比較

注：與對(duì)照組比較:aaP<0.01；與模型組比較:bP<0.05

2.3 大鼠肝組織炎癥因子的mRNA表達(dá)

表3顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中MCP1、IFNγ mRNA的表達(dá)明顯增高(P<0.05)，IL-10 mRNA有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IL-4的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。與模型組比較，健脾化痰組大鼠肝組織中IL-4、IL-10的mRNA表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MCP1、IFNγ的mRNA表達(dá)有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，易善復(fù)組大鼠肝組織中IL-4、IL-10的mRNA表達(dá)增高更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MCP1、IFNγ mRNA的表達(dá)有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 大鼠肝組織中炎癥因子的mRNA表達(dá)(Ratio)

注：與對(duì)照組比較:aP<0.05；與模型組比較:bP<0.05，bbP<0.01

3 討論

脾虛生痰是脂肪肝形成的重要病機(jī)之一，脾主運(yùn)化、統(tǒng)血、主升清，脾主運(yùn)化體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是運(yùn)化水谷精微，二是運(yùn)化水濕。而飲食不節(jié)則會(huì)損傷脾胃，使脾的運(yùn)化功能受損，不能正常消化飲食和轉(zhuǎn)輸水液，導(dǎo)致痰濕內(nèi)生、蘊(yùn)結(jié)于肝而發(fā)本病。臨床亦證實(shí)，應(yīng)用健脾化痰法治療脂肪肝具有較好療效[7-9]。健脾化痰湯為《太平惠民和劑局方》中的二陳湯與四君子湯的和方，兼具健脾、化痰之功效。

目前公認(rèn)的NAFLD的發(fā)病機(jī)制是1998年Day等[1]提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)，即初次打擊由IR和高胰島素血癥導(dǎo)致的肝臟脂質(zhì)沉積，二次打擊為氧化損傷、炎癥反應(yīng)進(jìn)一步引起的脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化等過(guò)程。參與二次打擊的炎癥反應(yīng)在NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

C-反應(yīng)蛋白主要由肝細(xì)胞和成熟的脂肪細(xì)胞合成及分泌，其表達(dá)受炎癥因子的調(diào)控，如TNF-α、IL-1β等與IL-6的關(guān)系最為密切。CRP是急性期反應(yīng)蛋白的一種，是機(jī)體重要的防御分子，也是非特異性炎癥標(biāo)志物之一，與急慢性炎癥性疾病密切相關(guān)，具有誘導(dǎo)單核、巨噬細(xì)胞黏附、聚集、活化和細(xì)胞因子、ROS產(chǎn)生的作用[3、10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中CRP含量明顯高于對(duì)照組，提示機(jī)體可能處于炎癥狀態(tài)。健脾化痰組血清CRP含量較模型組明顯下降，提示健脾化痰湯可以抑制由高脂飲食引起的機(jī)體炎癥狀態(tài)，健脾化痰湯對(duì)脂肪肝的抑制作用亦可能與其抗炎作用有關(guān)。

由“二次打擊”學(xué)說(shuō)可看出，細(xì)胞因子在NASH的發(fā)病機(jī)制中起很重要的作用。肝組織中的巨噬細(xì)胞(Kuppfer 細(xì)胞)是細(xì)胞因子產(chǎn)生的重要來(lái)源，巨噬細(xì)胞根據(jù)誘導(dǎo)因素、受體表達(dá)、分泌細(xì)胞因子及功能的不同分為兩類，即經(jīng)典活化型(classically activated macrophages，M1型)和替代活化型(alternatively activated macrophages，M2型)。IFNγ是M1型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)因子，MCP1是M1型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有招募炎性巨噬細(xì)胞的作用[11]；IL-4是M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)因子，IL-10是M2型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)，M2型巨噬細(xì)胞具有抑炎作用[6、12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中M1型誘導(dǎo)因子(IFNγ)和分泌因子(MCP1)的表達(dá)明顯增高，而模型組M2型誘導(dǎo)因子(IL-4)無(wú)明顯變化，M2型分泌因子(IL-10)有下降趨勢(shì)，說(shuō)明模型組大鼠肝組織中巨噬細(xì)胞向M1型分化。健脾化痰組大鼠肝組織中M2型因子IL-4、IL-10表達(dá)明顯增高，而M1型因子MCP1、IFNγ的表達(dá)僅有下降趨勢(shì)，即健脾化痰組大鼠肝組織中有利于M2型巨噬細(xì)胞分化的Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生增高。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，M1型和M2型巨噬細(xì)胞極化的動(dòng)態(tài)改變調(diào)節(jié)天然免疫參與的各種炎癥反應(yīng)[13]，提示健脾化痰湯抑制高脂飲食引起的非酒精性脂肪肝作用可能是通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化，從而抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，長(zhǎng)期高脂飲食加脂肪乳灌胃可造成大鼠機(jī)體處于(慢性)炎癥狀態(tài)，健脾化痰湯對(duì)機(jī)體(慢性)炎癥狀態(tài)有一定的緩解作用，健脾化痰湯對(duì)肝臟的保護(hù)作用亦可能與促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2分化有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] DAY CP, JAMES OF. Steatohepatitis: a tale of two hits? [J]. Gastroenterology,1998，114(4):842-845．

[2] LAGO F, DIEGUEZ C, GOMEZ-REINO J, GUALILLO O. Adipokines as emerging mediators of immune response and inflammation[J].Nature Clinical Practice Rheumatology, 2007,3(12)：716-724.

[3] KUMAGAI K， KIYOSAWA N，ITO K ，et al． Influence of Kupffer cell inactivation on cycloheximide-induced hepatic injury[J]．Toxicology,2007，241(3):106-118．

[4] POLFLIET MM，F(xiàn)ABRIEK BO，DANILS WP, et al． The rat macrophage scavenger receptor CD163: expression，regulation and role in inflammatory mediator production[J]．Immunobiology,2006，211(6-8):419-425．

[5] GORDON S,MARTINEZ FO. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions[J]．Immunity,2010，32(5):593-604．

[6] MCNELIS JC，OLEFSKY JM． Macrophages，immunity，and metabolic disease[J]．Immunity,2014，41(1): 36-48．

[7] 顧恪波. 中醫(yī)藥辨病辨證治療脂肪肝的文獻(xiàn)分析[J]. 遼寧中醫(yī)雜志,2011，38(4)：788-790．

[8] 熊文生，李會(huì)杰. 健脾化痰法治療痰濁內(nèi)阻型非酒精性脂肪肝臨床觀察[J]. 新中醫(yī),2011,43(2)：47-49．

[9] 林志榮，范航，鄧欣，等. 自擬健脾化痰方治療非酒精性脂肪性肝炎57例療效觀察[J]. 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2010，20(1)：48-49．

[10] UGE-AUBRY CE, HENRICHOT E, MEIER CA. Adipose tissue: a regulator of inflammation [J]. Best Pract Res Clin Endocrinol MeTab,2005，19(4)：547-566.

[11] BLéRIOT C,DUPUIS T,JOUVION G, et al． Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection[J]．Immunity,2015，42(1): 145-158．

[12] JI H, SHEN X, GAO F, et al. Programmed death-1/B7-H1 negative costimulation protects mouse liver against ischemia and reperfusion injury[J]．Hepatology,2010，52(4): 1380-1389．

[13] GEISSMANN F, MANZ MG, JUNG S, et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells[J].Science,2010，327(5966): 656-661.