沙 杰， 范理宏

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)，南京 211166； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院呼吸科，上海 200072)

肺癌是全球范圍內(nèi)致死率最高的惡性腫瘤，每年造成120萬人的死亡，其中非小細(xì)胞肺癌占到了80%～85%。而在我國，肺癌已成為男性惡性腫瘤發(fā)病率首位，女性的第二位。其總體5年存活率低至15%。若能在早期被及時診斷與干預(yù)的話，其5年存活率能顯著提高至61%～90%[1-2]。但不幸的是，多數(shù)患者由于缺乏有效的早期診斷，約75%的患者在腫瘤晚期出現(xiàn)癥狀時才得到相應(yīng)治療，早已錯過了最佳治療時期。所以如何在肺癌早期對患者作出及時的診斷成為重中之重。

臨床工作中的重點難點是對于肺部結(jié)節(jié)良惡性鑒別，單一通過影像學(xué)表現(xiàn)易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，延誤患者最佳治療時機(jī)?，F(xiàn)階段病理活檢是肺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn),例如影像引導(dǎo)下的肺穿刺和支氣管鏡活檢，但這類有創(chuàng)檢查對患者存在潛在的風(fēng)險?，F(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物靈敏度及特異性都無法達(dá)到臨床要求。所以一種更理想的檢查方法有待被發(fā)現(xiàn)，它應(yīng)具有無創(chuàng)、高靈敏度、高特異性、簡單方便等特性。Micro RNAs(miRNAs)是一類長度為20～24個核苷酸的非編碼小分子RNA，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥等密切相關(guān)。多項研究已證實miRNAs具有腫瘤抑制或促進(jìn)的作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)血清/血漿中存有miRNAs，稱為循環(huán)miRNAs。循環(huán)miRNAs能以Ago2-miRNA蛋白復(fù)合物的形式穩(wěn)定存在于血漿中而逃避RNase降解。故通過對比腫瘤患者與健康人循環(huán)血中的miRNAs表達(dá)譜，對不同腫瘤中miRNAs的特異性表達(dá)譜進(jìn)行鑒定，將有助于腫瘤的早期診斷[6]。本課題組前期研究[7]通過對非小細(xì)胞肺癌病例與健康人病例的血清miRNAs表達(dá)譜分析，篩選出了具有診斷價值的miRNAs。本次研究基于以上結(jié)果，進(jìn)一步檢測118例早期非小細(xì)胞肺癌、42例肺部良性結(jié)節(jié)、48例健康人的6種(miR-15b-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-92a-3p、miR-146b-3p)循環(huán)血miRNAs表達(dá)水平，并分析其相關(guān)診斷價值。

1 資料與方法

1.1 資料收集

本研究獲得同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有入組病例血樣與臨床資料均收集于同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院2015年10月至2016年4月間。肺結(jié)節(jié)病例采集于胸外科及呼吸科所有擬行手術(shù)或活檢且影像學(xué)最大直徑≤30mm的肺結(jié)節(jié)患者，共計250例，于術(shù)前1～2周采集血樣，待確定其病理診斷后篩選入組。最終非小細(xì)胞肺癌入組118例，良性結(jié)節(jié)入組42例。非小細(xì)胞肺癌組中腺癌110例，鱗癌8例，見圖1。入組標(biāo)準(zhǔn)包括： (1) 病理診斷；(2) 結(jié)節(jié)直徑≤30mm；(3) 入組分期為T1N0M0(第8版肺癌分期)；(4) 無其他腫瘤史；(5) 未進(jìn)行放化療；(6) 肺內(nèi)無活動性炎癥。良性結(jié)節(jié)組包括25例肉芽腫性結(jié)節(jié)、11例錯構(gòu)瘤等。健康人血樣收集于體檢人群，共48例經(jīng)確診均無肺內(nèi)活動性炎癥或任何相關(guān)腫瘤疾病。樣本在性別、年齡、吸煙史方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。樣本于晨間空腹采集5ml全血，4℃，離心半徑5.8cm,3000r/min，離心15min，提取血清-80℃冰箱保存。

1.2 方法

本次研究使用miRNeasy Serum/Plasma kit (QIAGEN, 德國)RNA提取試劑盒，按照使用手冊從200μL血清中提取14μL總RNA，并使用NanoDrop 2000微量分光光度計測定其濃度與純度。miRNAs反轉(zhuǎn)錄試劑盒(灝勤生物)反轉(zhuǎn)錄得到20μL cDNA，其反應(yīng)體系包括dNTP 4μL，反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，特定緩沖液4μL，莖環(huán)引物1μL，總RNA 5μL，加RNase-Free水補(bǔ)足至20μL。使用Eppendorf MCpro設(shè)定反轉(zhuǎn)錄程序為42℃孵育40min，70℃孵育15min。下步使用miRNAs熒光定量檢測試劑盒(灝勤生物)進(jìn)行RT-PCR。其反應(yīng)體系包括緩沖液10μL，探針和引物預(yù)混液1μL，cDNA 1μL，加RNase-Free水補(bǔ)足至20μL。使用ABI 7900實時熒光定量PCR按照95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 30s、45個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

圖1 研究對象入組流程圖Fig.1 Flow chart of research objects

項目非小細(xì)胞肺癌良性結(jié)節(jié)P值健康人P值n1184248性別0 800 47 男502219 女682029年齡/歲57 08±12 1953 31±11 350 0659 21±9 190 22 ≥60531320 <60652928吸煙史0 300 41 是25713 否933535組織分型 腺癌110 鱗癌8 肉芽腫25 錯構(gòu)瘤11 其他6

2 結(jié) 果

2.1 miRNAs表達(dá)

結(jié)果顯示5種miRNAs(miR-15b-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-92a-3p、miR-146b-3p)在非小細(xì)胞肺癌與良性結(jié)節(jié)中有表達(dá)差異，同時5種miRNAs(miR-15b-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-146b-3p)在非小細(xì)胞肺癌與健康人中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.2 Logistic回歸

將上述具有差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，結(jié)果表明在非小細(xì)胞肺癌與良性結(jié)節(jié)組中： miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-146b-3p具有顯著的預(yù)測性；同時在非小細(xì)胞肺癌與健康人組中： miR-15b-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-146b-3p具有顯著預(yù)測性，見表3。

進(jìn)一步將肺癌與良性結(jié)節(jié)組通過多因素Logistic回歸分析計算，得出年齡與miR-146b-3p為相關(guān)獨立危險因素，Logistic回歸公式為Logit(P)=1.16×年齡+1.76×miR-146b-3p；同理得出肺癌與健康人組中miR-19a-3p與miR-146b-3p為相關(guān)獨立危險因素，Logistic回歸公式為Logit(P)=3.39×miR-19a-3p+5.57×miR-146b-3p，見表4。

表2 6種miRNAs相對表達(dá)量

表3 單因素Logistic回歸

表4 多因素Logistic回歸

2.3 ROC曲線

肺癌與良性結(jié)節(jié)組中： miR-146b-3p的曲線下面積(AUC)為0.77，當(dāng)取臨界值0.01時，靈敏度為75%，特異性為71%。MiR-Panel的曲線下面積為0.81，當(dāng)取臨界值0.85時，靈敏度為65%，特異性為89%，見圖3。同時收集并分析肺癌與良性肺結(jié)節(jié)病例臨床常用的腫瘤標(biāo)志物(AFP、CEA、NSE、SCC、CA153、CA211、CA50、CA199)曲線下面積,其大小自0.41至0.59不等，明顯低于前二者，并不具備明顯的早期臨床診斷價值；

肺癌與健康人組中： miR-146b-3p的曲線下面積(AUC)為0.93，當(dāng)取臨界值0.72時，靈敏度為89%，特異性為84%。miR-19a-3p的曲線下面積(AUC)為0.93，當(dāng)取臨界值0.76時，靈敏度為84%，特異性為92%。MiR-Panel的曲線下面積更是達(dá)到0.98，當(dāng)取臨界值0.90時，靈敏度為94%，特異性為95%見圖2。

圖2 MiRNAs ROC曲線Tab.2 ROC curve of miRNAsA： 肺癌與良性結(jié)節(jié)組miR-146b-3p ROC曲線;B： 肺癌與良性結(jié)節(jié)組miR-Panel ROC曲線;C： 肺癌與良性結(jié)節(jié)組腫瘤標(biāo)志物ROC曲線;D： 肺癌與健康人組miR-146b-3p ROC曲線;E： 肺癌與健康人組miR-19a-3p ROC曲線;F： 肺癌與健康人組miR-Panel ROC曲線

3 討 論

隨著低劑量螺旋CT(low-dose computed tomog-raphy, LDCT)的普及與發(fā)展，肺部結(jié)節(jié)的檢出率也隨之提高。這類結(jié)節(jié)大體可分為惡性與良性兩類。良性病變中感染性肉芽腫占多數(shù)、錯構(gòu)瘤，還包括血管性、淋巴性病變等。惡性結(jié)節(jié)主要包括腺癌、鱗癌、轉(zhuǎn)移瘤。盡管多數(shù)結(jié)節(jié)最后經(jīng)病理診斷為良性，但仍有部分結(jié)節(jié)性質(zhì)可疑，僅通過影像學(xué)分析難以診斷，必須進(jìn)行有創(chuàng)活檢，這無疑增加了患者的醫(yī)療成本與心理負(fù)擔(dān)。所以急需一種無創(chuàng)的檢查方法與影像學(xué)檢查進(jìn)行補(bǔ)充。早有報道表明miRNAs與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥等密切相關(guān)，且miRNAs取材方便，可連續(xù)監(jiān)測，有望成為一種理想的潛在血清腫瘤標(biāo)志物。

MiR-146家族包括miR-146a和miR-146b，分別位于人第5號和第10號染色體，其序列高度保守且與成熟序列僅有2個堿基之差，在生命活動中承擔(dān)了眾多作用。miR-146家族是第1個被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)免疫的miRNA，研究證實在固有免疫TLR(Toll-like receptors)通路中miR-146擔(dān)任負(fù)向調(diào)節(jié)作用，即當(dāng)miR-146過表達(dá)時，其兩個重要靶基因IRAK1和TRAF6表達(dá)均下調(diào)。miR-146的抑癌作用與下調(diào)信號通路中NF-κB的表達(dá)有關(guān)。而在肺癌方面，Sweta等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，miR-146b-3p在肺腺癌患者血清中呈顯著過表達(dá)，但目前尚缺乏miR-146b-3p對于肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制研究。已有多項報道[9-13]表明，非小細(xì)胞肺癌與健康人中的循環(huán)血miRNAs具有表達(dá)差異。Boeri等[14]的報道中表明miRNAs作為肺癌早期診斷的臨床價值。此外，Chen等[15]通過對比400例非小細(xì)胞肺癌與220例健康對照組的miRNAs表達(dá)，發(fā)現(xiàn)10種miRNAs表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。陳昊等[16]通過對206例非小細(xì)胞肺癌與135例健康人的外周循環(huán)血miRNAs表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)miRNA，可作為非小細(xì)胞肺癌非侵入性診斷標(biāo)志物。但現(xiàn)研究缺少對于肺部良性結(jié)節(jié)的報道。良性結(jié)節(jié)的發(fā)生發(fā)展導(dǎo)致了肺內(nèi)微環(huán)境的改變，同時也致使miRNAs發(fā)生異常表達(dá)。所以通過分析比較非小細(xì)胞肺癌與良性結(jié)節(jié)的miRNAs表達(dá)譜，即可對兩者進(jìn)行鑒別診斷。

通過對早期非小細(xì)胞肺癌、肺部良性結(jié)節(jié)患者與健康人群外周循環(huán)血6種miRNAs表達(dá)進(jìn)行檢測對比，本研究發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p在非小細(xì)胞肺癌患者外周循環(huán)血中呈過表達(dá)，顯著高于肺部良性結(jié)節(jié)與健康人群。與本課題組前期實驗相同： miR-15b-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p在非小細(xì)胞肺癌與健康人中呈差異表達(dá)。Logistic回歸分析表明在肺癌與良性結(jié)節(jié)組中，年齡與miR-146b-3p為相關(guān)獨立危險因素，肺癌與健康人組中miR-19a-3p與miR-146b-3p為相關(guān)獨立危險因素，且有較高的特異性(95%)和靈敏度(94%)，相較于當(dāng)前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，具有更強(qiáng)的早期鑒別診斷能力。

綜上所述，本次研究結(jié)果表明血清miR-146b-3p在非小細(xì)胞肺癌、肺部良性結(jié)節(jié)患者與健康人群的早期鑒別診斷中具有一定的價值和潛力，可作為一種新的血清腫瘤標(biāo)志物，很好的彌補(bǔ)了影像學(xué)檢查在早期肺部結(jié)節(jié)良惡性判定上的劣勢。通過進(jìn)一步的基礎(chǔ)機(jī)制研究和大規(guī)模臨床驗證，有望能提高早期肺部結(jié)節(jié)良惡性鑒別的準(zhǔn)確性。

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