陸志峰， 趙 麗， 王 勝

(同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200072)

膿毒癥是燒傷、創(chuàng)傷、感染等臨床危急重癥患者的常見并發(fā)癥，可導(dǎo)致多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，影響患者預(yù)后[1]。因而膿毒癥誘導(dǎo)MODS的機制是近年來膿毒癥研究的主攻方向，心臟、肝臟和肺等重要臟器的損傷和功能衰竭則是關(guān)注的焦點[2]。其實，膿毒癥也會導(dǎo)致胰腺外分泌功能障礙，且與預(yù)后密切相關(guān)，但發(fā)病機制尚不清楚[3]。線粒體損傷在膿毒癥MODS發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[4-5]，而線粒體損傷又與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[6]。烏司他丁(ulinastatin,UTI)是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種廣譜蛋白酶抑制劑，廣泛用于MODS、休克、胰腺炎等疾病[7]。本研究旨在觀察急性膿毒癥時大鼠胰腺外分泌功能受損時的細(xì)胞凋亡情況，并探討烏司他丁是否能通過抑制細(xì)胞凋亡從而保護胰腺外分泌功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

清潔級SD大鼠30只，體質(zhì)量(300±30) g，雄性，實驗前禁食12h，自由飲水，購自同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院中心實驗室。脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司，烏司他丁(UTI)購自廣州天普生化醫(yī)藥股份有限公司；TNF-α檢測試劑盒由欣博盛生物科技公司生產(chǎn)；兔抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)、凋亡蛋白酶Caspase3、細(xì)胞色素C(CytC)購自武漢谷歌生物科技公司；TUNEL試劑盒購自美國羅氏公司。

1.2 動物實驗

按隨機數(shù)字表法分為對照組、LPS組和UTI組，每組各10只。腹腔內(nèi)注射LPS 15mg/kg建立膿毒癥模型，UTI組在腹腔內(nèi)注射LPS后立即按照50000U/kg體質(zhì)量注射UTI，模型組在腹腔內(nèi)注射LPS后立即注射相同容量的生理鹽水，對照組注射等量的生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集

12h后存活大鼠(LPS組死亡2只)用2%戊巴比妥50mg/kg腹腔注射麻醉，沿股靜脈走向作長約2～3cm的切口。用止血鉗小心分離肌肉及筋膜，清楚地暴露出股三角區(qū)，22G靜脈穿刺針穿刺股靜脈并留置。經(jīng)該導(dǎo)管采集血標(biāo)本，置入離心管中，4℃，離心半徑10cm，4000r/min，離心10min，分離血清，-20℃冰箱保存，用于淀粉酶、脂肪酶及TNF-α等的檢測。取血后斷頭處死大鼠，取中上腹部正中切口，迅速取下胰腺。一部分用于H-E染色，剩余部分液氮冷凍后-70℃保存，用于凋亡相關(guān)蛋白提取等檢測。

1.4 血清淀粉酶、脂肪酶檢測

使用全自動生化分析儀(日立全自動生化分析儀7180)檢測血清淀粉酶、脂肪酶含量。

1.5 TNF-α檢測

根據(jù)試劑盒說明書進行操作。用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清TNF-α含量。

1.6 胰腺組織病理學(xué)檢測

取胰腺組織，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、H-E染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。每份標(biāo)本切片5張，每張高倍鏡行下連續(xù)觀察5個視野，根據(jù)改良Schmidt評分標(biāo)準(zhǔn)[8]分別評分后計算各項的平均值及總評分。評分內(nèi)容如下。(1) 水腫： 0分為無;1分為輕度葉間隙增寬;2分為重度葉間隙增寬;3分為腺泡間隙增寬;4分為細(xì)胞間隙增寬。(2) 炎性細(xì)胞浸潤： 計數(shù)高倍視野下血管周圍或小葉內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量,0～1個為0分;2～10個為1分;11～20個為2分;21～30個為3分;≥30個或出現(xiàn)微膿腫為4分。(3) 出血： 0分為無;1分為有。(4) 壞死： 0分為無;1分為壞死面積1%～10%;2分為壞死面積11%～20%;3分為壞死面積21%～30%;4分為壞死面積>30%。(1)、(2)、(3)及(4)之和為胰腺組織損傷病理積分。

1.7 TUNEL法計數(shù)凋亡細(xì)胞

使用TUNEL試劑盒檢測胰腺細(xì)胞凋亡，制作石蠟切片,經(jīng)脫蠟、水合,細(xì)胞通透,加TUNEL反應(yīng)液,加converter-POD,與底物DAB反應(yīng)顯色后,在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗

胰腺組織塊用冷PBS洗滌2～3次，加入10倍組織體積的組織裂解液，冰上徹底勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。離心半徑10cm，10500r/min離心10min，收集上清液，即為總蛋白溶液。用BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣，進行丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗4℃孵育過夜。次日，加二抗孵育后曝光。最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。將膠片進行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血清淀粉酶、脂肪酶和TNF-α含量

LPS組和UTI組淀粉酶、脂肪酶和TNF-α含量均顯著高于對照組(P<0.01)；UTI組淀粉酶、脂肪酶和TNF-α含量顯著均低于LPS組(P<0.01)，見表1。

表1 血清淀粉酶、脂肪酶和TNF-α含量

與對照組相比，#P<0.01；與LPS組相比，*P<0.01

2.2 H-E染色結(jié)果

對照組大鼠胰腺小葉結(jié)構(gòu)完整，小葉間隙致密，血管結(jié)構(gòu)正常，胰島結(jié)構(gòu)完整；LPS組細(xì)胞間隙增寬、少許炎性細(xì)胞浸潤伴少許出血；UTI組腺泡間隙增寬，見圖1。改良Schmidt評分分別為0、5.13和3.70分，UTI組顯著低于LPS組(P<0.01)。

圖1 大鼠胰腺組織光鏡觀察結(jié)果(H-E，×200)Fig.1 Pancreas tissues under light microscope(H-E,×200)A： 對照組；B： LPS組；C： UTI組

2.3 TUNEL計數(shù)凋亡細(xì)胞指數(shù)

對照組有少量凋亡細(xì)胞，LPS組凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P<0.01)；UTI組凋亡指數(shù)顯著低于LPS組(P<0.01)，見圖2。

圖2 大鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)Fig.2 The apoptosis index of pancreatic cells與對照組相比，#P<0.01；與LPS組相比，*P<0.01

2.4 凋亡相關(guān)蛋白表達

與對照組相比，LPS組胰腺組織中促凋亡蛋白Bax、CytC、Caspase3表達顯著增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2則顯著下降，而烏司他丁能對上述異常表達蛋白起到顯著恢復(fù)作用，見圖3。

3 討 論

胰腺外分泌功能不全(pancreatic exocrine insufficience, PEI)是指各種原因引起的胰酶分泌不足、胰酶活性不足或者胰酶過早降解，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)消化吸收不良等癥狀[9-10]，常見于原發(fā)胰腺疾病。但是現(xiàn)在也有許多證據(jù)表明在沒有原發(fā)胰腺疾病的重癥患者合并胰腺損傷和PEI的比例很高[11]。2003年Tribl等[12]研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者存在胰腺外分泌功能不全，其中膿毒癥合并休克患者尤甚。最近的流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者合并胰腺外分泌功能不全的比例超過50%，約20%甚至被診斷為重度胰腺外分泌功能不全[13]。本研究通過動物實驗發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠的血清淀粉酶、脂肪酶明顯升高，證實了膿毒癥中存在胰腺功能損傷。但目前，膿毒癥中胰腺功能損傷的發(fā)病機制尚未完全闡明[14]。有研究[15]表明，細(xì)胞凋亡是膿毒癥時重要的病理變化之一。

本研究發(fā)現(xiàn)LPS組血清TNF-α水平顯著升高，而TNF-α可誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡[16]，腺泡細(xì)胞凋亡后又可正反饋地促進TNF-α等炎癥介質(zhì)的合成與釋放[17]，從而觸發(fā)炎癥介質(zhì)瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)。清除TNF-α則可以減輕胰腺組織的炎性損傷[18]，與本研究UTI組結(jié)果一致。

Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中起著重要作用，既有促進凋亡作用，也有抗凋亡的作用[19]。Bax是線粒體途徑上促進急性胰腺炎時腺泡細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因[20]，可以增加線粒體膜通透性，促進細(xì)胞色素C(CytC)的釋放，形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，作用于凋亡效應(yīng)因子導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。相反，Bcl-2是主要的抗凋亡因子，與BH3結(jié)構(gòu)域形成異二聚體，維持促凋亡蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位分布，保護細(xì)胞不進入凋亡程序，而且Bcl-2還能抑制CytC的釋放，使CytC無法達到激活下游天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的閥值，保護細(xì)胞不發(fā)生凋亡[19]。Caspases家族是一類與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，Caspases激活后可以酶切底物天冬氨酸羧基端從而促進細(xì)胞凋亡發(fā)生。迄今為止已知有14種Caspases，其中Caspase 3是細(xì)胞凋亡主要的執(zhí)行者之一[21]。CytC是呼吸鏈中重要的電子傳遞體，它是第一種被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放的促凋亡蛋白[22]，當(dāng)線粒體損傷后，CytC穿過Bax孔隙移位到細(xì)胞質(zhì)[23]，與Apafl及dATP組裝成凋亡小體[24]，激活下游的Caspase 9，活化的Caspase 9進一步激活Caspase 3，引起Caspases級聯(lián)激活反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)LPS組凋亡細(xì)胞指數(shù)增高，促凋亡蛋白Bax、CytC、Caspase 3表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下降，伴血淀粉酶明顯升高、胰腺組織病理損傷加重，提示細(xì)胞凋亡參與膿毒癥胰腺外分泌功能損傷。而在UTI組上述異常指標(biāo)可見顯著逆轉(zhuǎn)，提示發(fā)生膿毒癥時烏司他丁可以抑制細(xì)胞凋亡，減輕胰腺損傷。烏司他丁可同時抑制多種蛋白酶，已證實其有強大的抗炎癥介質(zhì)、抗氧自由基作用，可減輕炎癥反應(yīng)、抑制凋亡等[25-26]。

綜上，本研究認(rèn)為LPS誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠存在胰腺外分泌功能損傷；烏司他丁可以保護膿毒癥大鼠胰腺外分泌功能，抑制膿毒癥時的細(xì)胞凋亡可能為其保護機制之一。

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