樊啟林， 王志榮

(同濟大學附屬同濟醫(yī)院消化內科，上海 200065)

胃癌(gastric cancer, GC)是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，居全世界腫瘤發(fā)病率的第4位和癌癥死亡率的第2位[1]。因此對胃癌的深入研究具有重要的臨床意義和價值。蛋白-O-巖藻糖基轉移酶1(protein O-fucosyltransferase 1, POFUT1)在口腔癌和肝癌中明顯高表達[2-3]。以往的研究顯示，POFUT1在胃癌中表達明顯增高，可促進胃癌細胞生長、增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力。胃癌的生長、侵襲和轉移同其他實體腫瘤一樣，都依賴于新生血管形成過程中所提供的營養(yǎng)[5-6]。內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一種促腫瘤血管新生的重要因子，其表達水平與腫瘤的惡性程度、轉移和微血管密度等呈正相關。CD31為微血管密度(microvessel density, MVD)的標記物之一，可作為腫瘤血管新生能力的重要指標之一。本研究通過檢測裸鼠移植瘤組織中VEGF和CD31的表達及POFUT1和VEGF的蛋白表達來探討POFUT1在胃癌腫瘤血管形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

20只SPF級裸鼠，雄性，7～8周齡，體質量17～20g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。分籠飼養(yǎng)于同濟大學附屬同濟醫(yī)院中心實驗室SPF級動物房。BGC823人胃腺癌細胞由中國科學院上海細胞庫提供。

所用試劑POFUT1抗體購自Abcam公司，1∶500 稀釋；VEGF購自Abcam公司，1∶500稀釋；CD31購自Abcam公司，1∶1000稀釋；RIPA、多聚甲醛、免疫組織化學試劑盒、BCA試劑盒、ECL試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；Lipofectamine 2000試劑盒購自Invitrogen公司；POFUT1引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)與傳代

人胃腺癌BGC823細胞在DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中維持，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞為單層貼壁生長，待貼壁細胞融合達80%時以胰酶(含0.02%EDTA)消化傳代。以上各項操作均在同濟大學附屬同濟醫(yī)院動物實驗中心無菌細胞培養(yǎng)室的超凈臺中進行。

1.3 POFUT1低表達和過表達穩(wěn)定胃癌細胞株的構建

1.3.1 干擾慢病毒載體shRNA-POFUT1及過表達慢病毒載體PLV-POFUT1的構建 根據(jù)人POFUT1基因(NM_015352.1)序列設計2對Oligo序列，將其合成并進行退火形成雙鏈DNA。對干擾慢病毒載體PDS019_PL-shRNA-GFP-F進行連接反應，利用感受態(tài)細菌DH5α進行轉化反應。將菌液接種于LB培養(yǎng)基中，對挑選的質粒進行測序，將測序正確的菌液進行質粒抽提和進行質檢。干擾慢病毒構建使用的引物信息如下。POFUT1-495上游引物： 5′-CACC-GCCCATTCTGGGATCAGTTTCCGAAGAAACTGA-TCCCAGAATGGGC-3′;下游引物： 5′-AAAAGCC-CATTCTGGGATCAGTTTCTTCGGAAACTGATCC-CAGAATGGGC-3′。POFUT1-109上游引物： 5′-CA-CCGACCACTTTATTGGCAACTCGAAAGTTGCCA-ATAAAGTGGTC-3′；下游引物： 5′-AAAAGACCA-CTTTATTGGCAACTTTCGAGTTGCCAATAAAGT-GGTC-3′。設計針對POFUT1的過表達序列，序列信息如下： 5′-AGACTAGTTCTAGAATGGGCGCCGCC-GCGTGGGC-3′；5′-GAGGGGCGGGATCCTCAGAA-CTCGTCCCGCA-GCT-3′。利用PCR獲取POFUT1過表達片段，對載體進行酶切，不依賴連接酶(ligase independent clonign, LIC)方法連接載體與片段，送樣進行測序，結果比對一致后，進行質粒抽提。

1.3.2 shRNA-POFUT1、shRNA control、PLV-POFUT1及PLV contro1慢病毒包裝及滴度測定 取一滅菌EP管，將POFUT1過表達慢病毒質粒及包裝質粒按1∶3比例混勻置于EP管中，再向其加入無血清培養(yǎng)液，室溫放置10min；另取一EP管，加入LipofectamineTM2000和無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，室溫放置10min。將上述2個EP管的DNA溶液和脂質體溶液混在一起，室溫放置20min。將種植于六孔板中的293T細胞的培養(yǎng)液吸走，添加DNA-脂質體復合物，放回細胞培養(yǎng)箱孵育過夜。轉染后第3、5天陸續(xù)收獲含病毒的上清液，離心半徑8cm，3000r/min，離心20min，去除沉淀。收取培養(yǎng)上清液，顯微鏡下觀察包裝的效率。分裝病毒上清液，保存放置于-80℃。測定慢病毒滴度，將病毒10倍梯度稀釋，并設置10個稀釋度和空白對照，病毒轉染72h后加入殺稻瘟菌素進行抗性篩選，依據(jù)GFP熒光細胞克隆數(shù)計算慢病毒的滴度(TU/ml)。按同樣方法制備POFUT1穩(wěn)定低表達細胞株。

1.3.3 shRNA-POFUT1和PLV-POFUT1穩(wěn)定細胞株的篩選和檢測 將制備好的慢病毒shRNA-POFUT1、shRNA control、PLV-POFUT1及PLV contro1病毒液分別感染胃癌細胞BGC823(MOI 50)。對于shRNA-POFUT1、shRNA control兩組的BGC823細胞，用含有殺稻瘟菌素的DMEM培養(yǎng)液進行細胞傳代培養(yǎng)，篩選穩(wěn)定轉染克隆，將穩(wěn)定轉染的細胞命名為shRNA-POFUT1-BGC823、shctl-BGC823。對于PLV-POFUT1及PLV contro1兩組的BGC823細胞，在DMEM培養(yǎng)液中加入嘌呤霉素進行抗生素篩選，將穩(wěn)定轉染的細胞命名為PLV-POFUT1-BGC823及PLV contro1-BGC823細胞。提取以上4種細胞總蛋白，Western印跡法檢測穩(wěn)定表達胃癌細胞系中POFUT1表達水平的變化。

1.4 裸鼠移植瘤體內生長曲線的測定及比較

取對數(shù)生長期4種BGC823細胞復蘇、傳代后進行常規(guī)收集，用DMEM培養(yǎng)液調整細胞終密度至5×107個/ml。取0.2ml細胞懸液接種于裸鼠右下肢根部背部皮下。隔日觀察成瘤情況并記錄時間，每3d用游標卡尺測量腫瘤大小，并重復測量3次，取平均值，按公式V=L×W2/2(L為最長徑，W為與L相垂直的橫徑)計算瘤體積。接種第30天，末次測量后頸椎脫臼處死，切除腫瘤測量大小并做后續(xù)檢測。繪制各組腫瘤生長曲線并比較。

1.5 免疫組織化學法檢測VEGF和MVD

用4%多聚甲醛固定瘤組織，石蠟包埋，4μm切片，標本切片嚴格按照免疫組織化學染色試劑盒步驟進行VEGF和CD31檢測。采用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)，在高倍視野(×400)下計數(shù)。參照Maeda[7]標準檢測瘤組織的MVD，首先在低倍鏡(×40)下整體觀察DC31染色的陽性血管(鄰近良性組織區(qū)域和微血管稀少硬化區(qū)除外)，并選擇MVD最高及“熱點”區(qū)域，計數(shù)MVC，求其平均值并計算MVD(MVD=MVC/面積，0.1885mm2/高倍視野)。微血管統(tǒng)計標準： 單個可與周圍血管、腫瘤細胞和其他結締組織區(qū)分的棕染內皮細胞或內皮細胞團，均可計數(shù)為1個微血管，無論是否形成管腔；基層較厚或管腔直徑>8個紅細胞直徑的血管均不計數(shù)[8]。VEGF判斷標準： 細胞內有棕黃或棕褐色顆粒且強度高于背景的著色細胞為陽性細胞，無棕黃或棕褐色顆粒為陰性細胞[9]。

1.6 Western印跡法檢測裸鼠瘤組織中POFUT1和VEGF的蛋白表達

將腫瘤組織加入裂解液行超聲粉碎，嚴格按BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。經(jīng)10% SOS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將等量蛋白轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，POFUT1和VEGF一抗4℃孵育過夜，室溫1h孵育二抗(CST)，ECL化學發(fā)光試劑顯影檢測POFUT1和VEGF的蛋白。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 裸鼠接種BGC823后的一般情況

皮下接種shRNA-POFUT1、PLV-POFUT1及其對照組人胃癌BGC823細胞后3～4d，接種部位出現(xiàn)直徑約0.3cm大小的腫瘤結節(jié)，成瘤率為100%。觀察和檢測期間，所有裸鼠均未出現(xiàn)明顯的活動減少、反應遲鈍、精神萎靡、消瘦等現(xiàn)象。試驗結束時無一裸鼠死亡。

2.2 各組細胞間POFUT1蛋白表達差異

Western印跡法顯示，與shRNA control組相比,shRNA-POFUT1組的POFUT1蛋白表達水平顯著下調；與PLV contro1相比，PLV-POFUT1組的POFUT1蛋白水平顯著增強，證實轉染成功，見圖1。

圖1 慢病毒穩(wěn)轉胃癌細胞株BGC823中POFUT1表達水平Fig.1 The expressions of POFUT1 in shRNA-POFUT1, shRNA control, PLV-POFUT1 and PLV control BGC823 cells

2.3 各組裸鼠移植瘤生長

在shRNA-POFUT1、shRNA control兩組中裸鼠移植瘤體積均隨時間延長而逐漸增大，但shRNA-POFUT1組較shRNA control組腫瘤體積增殖曲線較陡直，表明shRNA-POFUT1組POFUT1基因低表達可顯著抑制移植瘤生長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在PLV-POFUT1及PLV contro1兩組中裸鼠移植瘤體積也呈隨時間延長而逐漸增大的趨勢，但PLV-POFUT1較PLV contro1組腫瘤體積增殖曲線較平緩，表明PLV-POFUT1組POFUT1基因過表達可顯著促進移植瘤生長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2、3。

2.4 各組免疫組化染色檢測VEGF、MVD結果比較

VEGF位于細胞的胞膜和細胞質，胞質尤為明顯，以胞膜或胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。結果顯示，shRNA-POFUT1組VEGF表達明顯低于shRNA control組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PLV-POFUT1組VEGF表達明顯高于PLV contro1組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CD31主要表達于血管內皮細胞中，陽性染色呈棕黃色顆粒狀(圖4)，PLV-POFUT1組表達陽性率顯著高于PLV control組；shRNA-POFUT1表達陽性率明顯低于shRNA control組(P<0.05)，見表1。

2.5 裸鼠腫瘤組織蛋白POFUT1和VEGF蛋白表達

Western印跡法顯示，與shRNA control組相比,shRNA-POFUT1組的POFUT1和VEGF蛋白表達水平均顯著下調；與PLV contro1相比PLV-POFUT1組的POFUT1和VEGF蛋白水平均顯著增強，見圖5。

圖2 shRNA-POFUT1和shRNA control組移植瘤體積的比較Fig.2 The comparison of volume of transplantated tumor between shRNA-POFUT1 and shRNA control groups

圖3 PLV-POFUT1和PLV control組移植瘤體積的比較Fig.3 The comparison of volume of transplanted tumor between PLV-POFUT1 and PLV control groups

圖4 4組移植瘤中VEGF和CD31的表達水平(SP,×400)Fig.4 The expressions of VEGF and CD31 in shRNA-POFUT1,shRNA control, PLV-POFUT1 and PLV control groups(SP,×400)

表14組移植瘤間VEGF和CD31表達差異

組別VEGFCD31shRNAcontrol0 53±0 0274 59±0 43shRNA?POFUT10 33±0 01?499 99±7 31?PLVcontrol0 42±0 0137 12±0 08PLV?POFUT10 92±0 01#10 69±0 17#

與shRNA control組相比，*P<0.05；與PLV control組相比，#P<0.05

圖5 裸鼠移植瘤中POFUT1和VEGF的蛋白表達水平Fig.5 Protein expressions of POFUT1 and VEGF in the transplanted tumors

3 討 論

胃癌作為一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，手術完全切除仍是治療未轉移胃癌患者的主要手段；但是胃癌術后復發(fā)率高達50%～70%，5年生存率僅20%～50%，而發(fā)生轉移的患者5年生存率低于5%，侵襲和轉移是導致胃癌患者死亡的最主要原因之一[1]。目前關于胃癌發(fā)病機制的研究主要集中于幽門螺桿菌、血管生成和基因改變方面。新生血管形成是由內皮祖細胞、內皮細胞、細胞基質在各種促血管生長因子的作用下共同完成的[10]。腫瘤血管新生是胃癌等實體瘤生長、浸潤和轉移非常關鍵的因素，一方面為其提供所需要的營養(yǎng)和新陳代謝的途徑，另一方面因其管壁通透性高而有利于腫瘤細胞的轉移[11]。VEGF是一種具有高度特異性的血管內皮細胞刺激因子和血管通透因子，不僅參與新生血管的構建，還促使內皮細胞發(fā)生遷移和血管內物質滲漏[12]。因此，VEGF與腫瘤血管新生密切相關，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要標志。蛋白-O-巖藻糖基轉移酶1(POFUT1)和蛋白-O-巖藻糖基轉移酶2(POFUT2)的結構十分相似，同屬于FUT家族，以GDP-Fuc為糖基供體將L-Fuc轉移到肽鏈Ser/Thr的側鏈羥基上，催化合成O-巖藻糖苷鍵[13]。POFUT1在機體的分化和發(fā)育過程中發(fā)揮極其重要的作用。有研究表明，沉默果蠅體內的POFUT1，會影響Notch受體-配體蛋白的互相結合，并影響其信號轉導，以至于果蠅出現(xiàn)機體發(fā)育不全[14]。另外，POFUT1基因突變可致小鼠胚胎發(fā)育出現(xiàn)異常[15]。目前，研究發(fā)現(xiàn)POFUT1在口腔癌中表達增高，而且POFUT1表達與腫瘤大小顯著相關，其表達能促進腫瘤進展，也可成為口腔癌診斷和治療的靶點[2]。POFUT1-Notch在肝癌中出現(xiàn)異?；罨琍OFUT1過表達能夠促進肝癌進展[3]。在胃癌方面，利用oncomine數(shù)據(jù)庫在mRNA水平分析胃黏膜上皮與胃癌中POFUT1的表達水平，對69例胃癌樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)在胃癌中POFUT1的表達顯著增加[16]。同時，在細胞水平上的研究表明，POFUT1可能通過Notch信號通路調控E-cadherin/β-catenin的表達而影響胃癌細胞的遷移和侵襲,POFUT1能夠促進胃癌細胞生長，增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力[16]。目前，對于POFUT-1在腫瘤血管新生中的作用機制尚不清楚，所以，本研究的創(chuàng)新處在于探討POFUT-1對人胃腺癌裸鼠移植瘤微血管生成的作用。本試驗通過制備人胃腺癌BGC823的POFUT-1慢病毒低表達及其對照組、過表達及其對照組細胞模型，采用皮下成瘤的方法，分別用這4組細胞構建裸鼠皮下移植瘤模型，然后觀察和測算腫瘤體積大小；30d后處死裸鼠并取瘤，應用免疫組化方法檢測3組中POFUT1、VEGF、CD31的表達及其差異；另采用Western印跡法檢測裸鼠瘤組織中POFUT1和VEGF的表達及其差異。結果顯示，POFUT1基因低表達可顯著抑制移植瘤生長，POFUT1基因過表達可顯著促進移植瘤生長；POFUT1基因低表達時裸鼠腫瘤組織中VEGF表達明顯低于shRNA control組，POFUT1過表達裸鼠腫瘤組織中VEGF表達明顯高于PLV control組。

綜上所述，POFUT1可能夠通過抑制腫瘤微血管生成和VEGF表達來抑制裸鼠移植瘤微血管的生成。這為胃癌的靶向治療提供了新的思路，具有重要的臨床應用價值，但該作用機制的研究尚不成熟，還需不斷研究探討。

【參考文獻】

[1] JEMAL A, BRAY F, CENTER M M, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2)： 69-90.

[2] YOKOTA S, OGAWARA K, KIMURA R, et al. Protein O-fucosyltransferase 1： a potential diagnostic marker and therapeutic target for human oral cancer[J]. Int J Oncol, 2013,43(6)： 1864-1870.

[3] MA L, DONG P, LIU L, et al. Overexpression of protein O-fucosyltransferase 1 accelerates hepatocellular carcinoma progression via the Notch signaling pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016,473(2)： 503-510.

[5] RUNDHAUG J E. Matrix metalloproteinases and angiogenesis[J]. J Cell Mol Med, 2005,9(2)： 267-285.

[6] BERGERS G, BENJAMIN L E. Tumorigenesis and the angiogenic switch[J]. Nat Rev Cancer, 2003,3： 401-410.

[7] MAEDA K, CHUNG Y S, TAKATSUKA S, et al．Tumour angiogenesis and tumour cell proliferation as prognostic indicators in gastric carcinoma[J]. Br J Cancer, 1995,72(2)： 319-323.

[8] WEIDNER N, FOLKMAN J, POZZA F, et al. Tumor angiogenesis： a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma[J]. J Nail Cancer lnst, 1992,84： 1875-1887.

[9] DIAS F J, ISSA J P, BARBOSA A P, et al. Effects of low-level laser irradiation in ultrastructural morphology，and immunoexpression of VEGF and VEGF R-2 of rat masseter muscle[J]. Micron, 2012,43： 237-244

[10] 顧聞宇.內皮祖細胞在腫瘤新生血管形成中的作用機制[J].同濟大學學報(醫(yī)學版),2012,(1)： 117-120,124.

[11] CHIEN C C, KEMPSON I M, WANG C L, et al. Complete microscale profiling of tumor microangiogenesis： a microradiological methodology reveals fundamental aspects of tumor angiogenesis and yields an array of quantitative parameters for its characterization[J]. Biotechnol Adv, 2013,31： 396-401

[12] NONAKA Y, YOSHIDA W, ABE K, et al. Affinity improvement of a VEGF a ptamer by in silico maturation for a sensitive VEGF-detection system[J]. Anal Chem, 2013,85： 1132-1137.

[13] CHEN C I, KEUSCH J J, KLEIN D, et al. Structure of human POFUT2： insights into thrombospondin type 1 repeat fold and O-fucosylation[J]. EMBO J, 2012,31(14)： 3183-3197.

[14] STAHL M, UEMURA K, GE C, et al. Roles of Pofut1 and O-fucose in mammalian Notch signaling[J]. J Biol Chem, 2008,283(20)： 13638-13651.

[15] YAO D, HUANG Y, HUANG X, et al. Protein O-fucosyltransferase 1 (Pofut1) regulates lymphoid and myeloid homeostasis through modulation of Notch receptor ligand interactions[J]. Blood, 2011,117(21)： 5652-5662.

[16] DONG S, WANG Z, HUANG B, et al. Bioinformatics insight into glycosyltransferase gene expression in gastric cancer： POFUT1 is a potential biomarker[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017,483(1)： 171-177.