張旭南， 王培軍

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院影像科,上海 200065)

肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤，居我國(guó)腫瘤發(fā)病率和死亡率的首位[1-2]。早期肺癌起病隱匿，常規(guī)臨床檢查難以發(fā)現(xiàn)微小癌灶，當(dāng)出現(xiàn)相應(yīng)的肺癌癥狀時(shí)，預(yù)示著肺癌進(jìn)展到中晚期或存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失根治可能。因此對(duì)肺癌早期診斷及治療的研究具有重要的臨床意義和價(jià)值。臨床常用檢查手段是采用CT探查肺癌病灶，但對(duì)小病灶缺乏較高的特異性。近年來(lái)隨著分子影像學(xué)的發(fā)展，由納米化藥物作為載體裝載成像劑并修飾腫瘤特異性標(biāo)記物而制成的分子影像探針，在細(xì)胞層面通過(guò)探針與癌細(xì)胞特異性高表達(dá)的蛋白發(fā)生反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)腫瘤早期敏感的特異性成像。RGD-Gd@BSA-Ce6是以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)作為載體[3]，裝載釓劑及光敏劑Ce6，使具有磁共振/熒光雙模態(tài)成像功能同時(shí)發(fā)揮光敏劑光動(dòng)力治療作用。文獻(xiàn)報(bào)道，整合素αvβ3受體在肺癌中明顯高表達(dá)[4]。αvβ3被證實(shí)參與了肺癌組織發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的新生血管形成。不僅如此，αvβ3受體在肺癌中的高表達(dá)又可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的惡性程度及耐化療藥的能力[5]。而小分子多肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp, RGD)[6]可特異性識(shí)別并結(jié)合整合素αvβ3受體，因此可作為與肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的靶向劑。本研究通過(guò)體外測(cè)定RGD-Gd@BSA-Ce6的弛豫率和其磁共振T1加權(quán)圖像，評(píng)估該納米探針的MR成像性能；采用激光共聚焦成像和細(xì)胞光照毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)估探針與肺癌細(xì)胞的靶向親和力和光動(dòng)力治療效果，MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)納米探針的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

環(huán)狀RDG小分子多肽、納米探針Gd@BSA-Ce6由同濟(jì)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與納米材料研究院李永勇教授實(shí)驗(yàn)課題組提供。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549由同濟(jì)大學(xué)附屬肺科醫(yī)院提供；DMEM高糖型培養(yǎng)液和PBS(磷酸鹽緩沖液)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

以下各項(xiàng)操作均在同濟(jì)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與納米材料研究院無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)室的超凈臺(tái)中進(jìn)行。人肺腺癌細(xì)胞A549在DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中維持，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞為單層貼壁生長(zhǎng)，待貼壁細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)以胰酶(含0.02%EDTA)消化傳代。

1.3 納米探針磁共振T1弛豫率及T1加權(quán)信號(hào)采集

將RGD-Gd@BSA-Ce6和商品化Gd-DTPA(商品名： 釓噴酸葡胺注射液)用PBS稀釋獲得不同濃度(以Gd3+的濃度計(jì)0.022、0.043、0.087、0.173、0.347、0.693mmol/L)，每一種濃度取200μL置于核磁管中，采用體外磁場(chǎng)發(fā)生儀(EIS AB MFG-1000 In Vitro Magnetic Field Generator)進(jìn)行T1弛豫時(shí)間數(shù)據(jù)的采集，并計(jì)算RGD-Gd@BSA-Ce6和Gd-DTPA各自T1的弛豫率。弛豫時(shí)間測(cè)量完成后，對(duì)r1值進(jìn)行擬合計(jì)算。

將所用樣品放置于磁共振線圈中(頭頸部線圈)，采用西門(mén)子公司3.0T磁共振(Siemens Verio 3.0T MRI)進(jìn)行橫斷位掃描，掃描參數(shù)為： 重復(fù)時(shí)間(repeat time,TR)=600ms，回波時(shí)間(echo time,TE)=10ms,層厚(slice thickness)=2.0mm,FOV read=150mm。將掃描圖像傳輸至工作站。

1.4 激光共聚焦成像

取懸浮在高糖DMEM培養(yǎng)液中的A549細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，配制成2ml細(xì)胞懸液接種在6孔板中(3.0×105/孔)。隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,待細(xì)胞貼壁。然后滴加Ce6、Gd@BSA-Ce6和RGD-Gd@BSA-Ce6(Ce6的最終濃度為0.6μmol/L)，在37℃下共培養(yǎng)2h，然后將細(xì)胞用PBS漂洗2次，每孔滴加4%多聚甲醛1ml固定10min，去除多聚甲醛后用0.5ml的DAPI染色10min。用PBS漂洗3次后，滴加抗熒光淬滅封片劑，錫箔紙封裝避光保存。最后采用共聚焦激光掃描顯微鏡成像。

1.5 A549細(xì)胞光動(dòng)力治療

將A549細(xì)胞懸液100μL/孔(細(xì)胞數(shù)目約為8×103)分別加入96孔板中，每一種濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,待細(xì)胞貼壁。將事先配置好的含藥培養(yǎng)基Gd@BSA-Ce6、RGD-Gd@BSA-Ce6和游離Ce6溶液(以Ce6濃度計(jì)： 0.3、0.6、1.2、2.4、4.8μmol/L)加入96孔板中(100μL/孔)共孵育24h。同時(shí)設(shè)立兩組對(duì)照組，一組加入不含任何細(xì)胞和納米材料的培養(yǎng)基，另一組只加入含細(xì)胞的培養(yǎng)基。取1個(gè)96孔板做光照組，給予650nm波長(zhǎng)光激發(fā)，強(qiáng)度為5mW/cm2，每孔光照持續(xù)3min。光激發(fā)結(jié)束將光照組96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，隨后每個(gè)孔加入CCK8檢測(cè)試劑20μL,再次孵育1h后使用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度(D450)并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 細(xì)胞水平生物安全性

為了了解細(xì)胞水平上RGD-Gd@BSA-Ce6探針的生物安全性，將293T細(xì)胞懸液100μL/孔(細(xì)胞數(shù)目約為8×103個(gè))加入到96孔板中，同樣每一種濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。待80%細(xì)胞融合貼壁，將事先配置好的含藥培養(yǎng)基Gd@BSA-Ce6、RGD-Gd@BSA-Ce6和游離Ce6溶液(以Ce6濃度計(jì)，具體濃度同實(shí)驗(yàn)1.5)加入96孔板中(100μL/孔)共孵育24h。每個(gè)孔加入MTT細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑10μL,37℃孵育4h后使用酶標(biāo)儀于490nm處測(cè)定每孔吸光度(D490)并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RGD-Gd@BSA-Ce6弛豫率測(cè)定結(jié)果

Gd3+造影劑是一種順磁性造影劑，其T1信號(hào)強(qiáng)度隨著Gd3+濃度的升高而增加，因此RGD-Gd@BSA-Ce6的成像效果可以通過(guò)T1弛豫率來(lái)評(píng)估。結(jié)果顯示，RGD-Gd@BSA-Ce6的弛豫系數(shù)為18.615，Gd-DTPA的弛豫系數(shù)為3.404，RGD-Gd@BSA-Ce6是Gd-DTPA的5.5倍，見(jiàn)圖1。T1加權(quán)圖像表現(xiàn)出隨著Gd3+濃度升高，二者的T1信號(hào)明顯增加，且同一濃度下RGD-Gd@BSA-Ce6的信號(hào)顯著高于Gd-DTPA，見(jiàn)圖2。

圖1 RGD-Gd@BSA-Ce6及 Gd-DTPA弛豫系數(shù)擬合圖Fig.1 The linear fitting chart about relaxation coefficient of RGD-Gd@BSA-Ce6 and Gd-DTPA

2.2 A549肺腺癌細(xì)胞對(duì)納米探針的攝取情況

共聚焦激光掃描顯微鏡結(jié)果顯示，與游離Ce6組相比，Gd@BSA-Ce6組的融合熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；而與Gd@BSA-Ce6組相比，RGD-Gd@BSA-Ce6組的融合熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，見(jiàn)圖3。

圖2 RGD-Gd@BSA-Ce6、Gd-DTPA和PBS磁共振T1加權(quán)圖Fig.2 MRI T1-weighted image of RGD-Gd@BSA-Ce6,Gd-DTPA and PBS

圖3 A549肺腺癌細(xì)胞分別與游離Ce6、Gd@BSA-Ce6、RGD-Gd@BSA-Ce6共孵育2h后的激光共聚焦圖像Fig.3 The laser confocal imaging of lung adenocarcinoma A549 cells incubated with free Ce6, Gd@BSA-Ce6 and RGD-Gd@BSA-Ce6 for 2hA1～3游離Ce6; B1～3： Gd@BSA-Ce6;C1～3： RGD-Gd@BSA-Ce6

2.3 納米探針對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞暗毒性和光毒性影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非光照組中不同濃度下三種藥物的細(xì)胞存活率都在60%以上，其組內(nèi)與組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且與不加藥物的對(duì)照組對(duì)比無(wú)明顯變化(P>0.05)。而光照組中，在特定波長(zhǎng)光激發(fā)下隨著濃度增加，各個(gè)處理組中相對(duì)細(xì)胞存活率呈減小趨勢(shì)，同時(shí)RGD-Gd@BSA-Ce6(Ce6濃度： 1.2～4.8μmol/L)處理組較相同Ce6濃度的游離Ce6組和Gd@BSA-Ce6組表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度游離Ce6、Gd@BSA-Ce6和RGD-Gd@BSA-Ce6作用于A549肺腺癌細(xì)胞24h后細(xì)胞相對(duì)活力圖Fig.4 The relative cell viability of lung adenocarcinoma A549 cells after incubation with different concentrations of free Ce6, Gd@BSA-Ce6 and RGD-Gd@BSA-Ce6 respectively A： 光照；B： 未光照

2.4 納米探針對(duì)293T細(xì)胞的生物安全性效應(yīng)

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在與不同濃度三種藥物共培養(yǎng)下，細(xì)胞存活率都在60%以上，各組內(nèi)與組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)且與不加藥物的對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度游離Ce6、Gd@BSA-Ce6和RGD-Gd@BSA-Ce6作用于293T細(xì)胞24h后細(xì)胞相對(duì)活力圖Fig.5 The relative cell viability of 293T cell after incubation with different concentrations of free Ce6, Gd@BSA-Ce6 and RGD-Gd@BSA-Ce6 respectively

3 討 論

在我國(guó)及世界范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率及死亡率在多種腫瘤中居于首位，死亡率皆在40%～54%左右，而且早期難以發(fā)現(xiàn)，確診患者中有75%已是肺癌晚期。作為一種高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤，肺癌已經(jīng)嚴(yán)重威脅了人類(lèi)身體健康并造成巨大的家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。肺癌的早期診斷和治療顯得尤為重要，而傳統(tǒng)的影像學(xué)診斷存在一定滯后性和低敏感性，分子影像技術(shù)可為實(shí)現(xiàn)早期診斷和治療提供有力支持。

整合素是一類(lèi)廣泛表達(dá)在細(xì)胞膜表面的受體蛋白，主要參與細(xì)胞間和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附作用。整合素家族中，αvβ3受體已被證實(shí)在腫瘤細(xì)胞及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面廣泛高表達(dá)，且參與腫瘤早期發(fā)生、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[7]，是一種針對(duì)肺癌等實(shí)體腫瘤的理想靶向標(biāo)記物。RGD作為一種靶向整合素αvβ3受體的小分子多肽,未來(lái)有望成為構(gòu)建靶向結(jié)合腫瘤組織的有效生物標(biāo)記物之一。

熒光成像由于其靈敏性高、重復(fù)性好、光穩(wěn)定性高、提供信息量多等優(yōu)點(diǎn)[8]，在生命科學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。在腫瘤成像方面，多種腫瘤靶向的標(biāo)記物可快速?gòu)V泛進(jìn)行熒光標(biāo)記，從而在細(xì)胞及分子水平獲取腫瘤發(fā)生、發(fā)展與周?chē)M織的關(guān)系等多種行為學(xué)信息。二氫卟吩e6(Ce6)提取于植物葉綠素，來(lái)源豐富，在腫瘤組織中選擇率高且正常組織代謝效率高。不僅如此，Ce6可在一定范圍內(nèi)波長(zhǎng)的激光照射下產(chǎn)生較多的單線態(tài)氧，發(fā)揮光動(dòng)力治療優(yōu)勢(shì)。由于Ce6容易在腫瘤組織內(nèi)富集，這使得產(chǎn)生的光動(dòng)力治療效果對(duì)腫瘤組織的選擇性高而減少對(duì)正常組織的損傷少。近幾年來(lái)研究表明，Ce6已在黑色素瘤[8]、肺癌[10]、膀胱癌[11]、皮膚癌[12]等多種腫瘤中表現(xiàn)出較好的治療功效。本研究表明，對(duì)比非光照條件下的靶向納米探針，光照條件下靶向納米探針具備對(duì)肺癌細(xì)胞的高效殺傷作用。

MRI作為一種臨床上廣泛應(yīng)用的成像技術(shù)具有高空間分辨率、高組織穿透性及無(wú)電離輻射等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又具有多參數(shù)、多序列成像以及血管成像、水成像、波譜成像等多種特殊成像功能，這使得其在分子影像研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，也成為實(shí)現(xiàn)雙/多模態(tài)成像功能的有效補(bǔ)充。目前臨床上最常用的MRI對(duì)比劑是T1對(duì)比劑(釓噴酸葡胺)。利用Gd3+這一強(qiáng)順磁性的金屬離子，可顯著縮短T1的馳豫時(shí)間，提高T1信號(hào)強(qiáng)度。本研究利用生物礦化技術(shù)制備整合素靶向的分子影像探針RGD-Gd@BSA-Ce6，通過(guò)弛豫率測(cè)定和T1加權(quán)圖像掃描，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出比商品化Gd-DTPA更顯著的成像性能。

BSA作為牛血清中的一種白蛋白，具有多種氨基酸殘基和可修飾官能團(tuán)，可與多種陽(yáng)離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結(jié)合，具有生物相容性良好、易修飾和合成綠色便捷等理化特性，在納米醫(yī)學(xué)和材料學(xué)領(lǐng)域被廣泛用作納米探針的載體[3，12]。本研究中通過(guò)生物礦化法合成RGD-Gd@BSA-Ce6分子影像探針，融合了熒光成像和MRI的優(yōu)勢(shì)且提高了光動(dòng)力治療效果，在激光共聚焦實(shí)驗(yàn)中,癌細(xì)胞對(duì)三種藥物存在明顯的結(jié)合能力差異。其可能的原因在于： 游離Ce6作為一種疏水性物質(zhì)，在血清或細(xì)胞外液中容易發(fā)生團(tuán)聚，不易被腫瘤細(xì)胞吞噬；而Gd@BSA-Ce6和RGD-Gd@BSA-Ce6有親水性的蛋白衣殼結(jié)構(gòu)包載Ce6,可增加其親水性。同時(shí)，由于整合素靶向結(jié)合多肽RGD的存在，使探針更加容易牢固聚集在腫瘤細(xì)胞周?chē)?，增加被攝取的概率。

生物大分子BSA包載的光敏劑和釓劑不僅能提高脂溶性的Ce6在血液和組織間液中的溶解性，而且在探針合成過(guò)程中聯(lián)合PEG修飾可顯著降低游離釓劑和Ce6對(duì)正常組織器官的毒性作用，保證納米探針在體內(nèi)的長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)，改善藥代動(dòng)力學(xué)。本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度下三種藥物與人胚胎腎細(xì)胞293T共孵育24h后各組細(xì)胞存活率均超過(guò)60%，這證實(shí)RGD-Gd@BSA-Ce6具有良好的生物相容性。然而，本研究也存在一些缺點(diǎn)： (1) 由于肺的構(gòu)造和功能特點(diǎn)，肺癌的早期臨床診斷主要依賴(lài)于CT，而MRI由于掃描時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)法避免因肺呼吸運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的偽影，因此目前MRI對(duì)肺癌診斷缺乏早期診斷優(yōu)勢(shì)。(2) 肺癌組織位于機(jī)體內(nèi)部，而Ce6的激發(fā)光對(duì)機(jī)體的穿透深度僅為1～3cm，有限的穿透能力尚不能激發(fā)聚集肺腫瘤組織上的納米探針產(chǎn)生良好成像和光動(dòng)力治療效應(yīng)。(3) 本實(shí)驗(yàn)并未在活體上進(jìn)行靶向成像實(shí)驗(yàn)和光動(dòng)力治療實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)外環(huán)境的差異對(duì)探針的成像和治療效果的影響仍無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估。

綜上所述，通過(guò)生物礦化技術(shù)制備具有整合素αvβ3受體靶向功能的BSA探針載體，包覆釓劑和光敏劑Ce6而制備成的影像探針，具有優(yōu)于商品化Gd-DTPA的T1成像性能和顯著的與A549肺癌細(xì)胞結(jié)合能力，可發(fā)揮良好的MRI和熒光雙模態(tài)成像和光動(dòng)力治療功效。它融合了MRI增強(qiáng)成像的高分辨率、高穿透深度和無(wú)輻射特點(diǎn)及熒光成像的敏感性高、光穩(wěn)定性良好、可重復(fù)利用、光照激發(fā)產(chǎn)生大量單線態(tài)氧等優(yōu)勢(shì)，避免了MRI的低敏感性和熒光成像受組織深度的限制等劣勢(shì)。MRI/熒光雙模態(tài)成像并輔助光動(dòng)力治療的影像探針，未來(lái)有望提高肺癌的檢出率和減少對(duì)比劑注入次數(shù)，并實(shí)現(xiàn)早期診斷、術(shù)中導(dǎo)航、輔助治療、術(shù)后評(píng)估等一系列診療措施，展現(xiàn)出新型分子影像探針巨大的診療一體化優(yōu)勢(shì)。

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