汪丙杰， 鄭賽巍， 馬聰聰， 史 聰， 李玉婷， 何 園

(1. 同濟大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，上海 200072；2. 同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院黏膜病學(xué)教研室-上海牙修復(fù)與再生工程實驗中心，上海 200072)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous carcinoma, OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，占全身腫瘤的3%[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)蛋白基因(transforming growth factor beta induced, TGFBI)在OSCC中表達升高[2]。TGFBI是一種由細胞分泌的細胞外基質(zhì)蛋白,在細胞和基質(zhì)分子之間充當(dāng)一種連接蛋白[3]。已有研究報道TGFBI在不同腫瘤中的表達水平不一致，在有些腫瘤例中表達升高，如結(jié)腸癌，而在另一些腫瘤中表達降低，如乳腺癌[5]，提示了其功能的復(fù)雜性。目前仍沒有關(guān)于TGFBI對OSCC影響的報道。CRISPR/Cas9技術(shù)是近年新興的基因編輯工具，其易于設(shè)計和高度特異性也為準(zhǔn)確的進行基因編輯提供了快速有效的方法[6]。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TGFBI基因敲除的HSC-3細胞系，以便于進一步研究TGFBI在OSCC中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和質(zhì)粒

口腔鱗狀細胞癌細胞系HSC-3由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室惠贈。PX330和PGK-puro質(zhì)粒由同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院費儉教授惠贈。

1.2 實驗試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、割膠回收試劑盒、DNA抽提試劑盒購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；BbsI限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京博邁德公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，青/鏈霉素購自美國Gbico公司；β-actin抗體、TGFBI抗體購自美國Proteintech公司；寡核苷酸單鏈合成、引物合成和質(zhì)粒測序由百力格公司服務(wù)完成。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) HSC-3細胞由含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并將培養(yǎng)皿置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.3.2 sgRNA 利用哈佛大學(xué)張峰實驗室提供的在線設(shè)計工具(http：∥crispr.mit.edu/)，根據(jù)CRISPR/Cas9靶點設(shè)計原則，設(shè)計了靶向TGFBI(ENST00000442011.6轉(zhuǎn)錄本)外顯子3的上下游的一對sgRNA，上游sgRNA(sgRNA1)序列為GGAGG-CAACTTAGTGGAGAG，下游sgRNA(sgRNA2)序列為AGGCTCTATGCGAGGGGCTG。

1.3.3 質(zhì)粒構(gòu)建 將經(jīng)過BbsI酶切的pX330質(zhì)粒與退火形成雙鏈的sgRNA混合，加入T4連接酶，反應(yīng)10h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，通過氨芐抗性涂板篩選，并挑取單克隆,測序鑒定。snapgene_viewer_2.8.3軟件分析測序結(jié)果，并將獲取的正確的質(zhì)粒分別命名為TGFBI-exon3-sgRNA1和TGFBI-exon3-sgRNA2質(zhì)粒。

1.3.4 細胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆挑選 將細胞鋪入24孔板中，待細胞密度達80%左右時，按照說明書，用LipofectamineTM3000將TGFBI-exon3-sgRNA1、TGFBI-exon3-sgRNA2和帶嘌呤霉素抗性的PGK-puro質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HSC-3細胞中。待轉(zhuǎn)染48h后，將細胞傳代至10cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，并在待細胞貼壁后加入嘌呤霉素(1μg/ml)進行篩選3d。經(jīng)過2周的培養(yǎng)后挑選細胞克隆，并擴大培養(yǎng)。

1.3.5 細胞克隆的鑒定 將擴大培養(yǎng)后的細胞克隆根據(jù)基因組提取試劑盒說明書提取DNA，并通過PCR擴增指定片段，上游引物序列： 5′-GCAGCCG-CCAGGAGCAT-3′，下游引物序列為： 5′-AAGGGC-CAAGTTTAGACACAGAG-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳后根據(jù)條帶初步確定TGFBI敲除克隆，并測序鑒定外顯子3是否刪除。

1.3.6 穩(wěn)定基因敲除細胞系的實時熒光定量PCR 采用TRIzol法提取細胞的總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于qRCR分析。擴增TGFBI及其他基因的引物序列以及內(nèi)參基因β-actin引物序列見表1。RT-qPCR反應(yīng)體系： SYBRGreen Mix 10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 2μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)條件： 95℃ 5min；95℃ 15s， 60℃ 15s，72℃ 20s，40個循環(huán)。并用2-ΔΔCt法分析基因相對表達情況。

表1 本次研究中合成的寡核苷酸序列

1.3.7 基因穩(wěn)定敲除細胞系的免疫印跡檢測 用RIPA提取細胞的總蛋白并用BCA法進行蛋白定量，每個樣各取50μg總蛋白，和上樣緩沖液混合后煮沸5min變性，完成蛋白樣本的制備。將樣本進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，并用5%脫脂奶粉室溫封閉1h。用一抗TGFBI及β-actin抗體在-4℃孵育過夜，之后用相應(yīng)的羊抗兔或羊抗鼠二抗進行孵育2h，最后用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進行掃描觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 重組表達載體PX330-TGFBI-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

PX330質(zhì)粒測序結(jié)果通過snapgene_viewer_2.8.3軟件分析得出的質(zhì)粒圖，包含2個BbsⅠ酶切位點(圖1A)。BbsⅠ酶切后回收的空載體分別和sgRNA1、sgRNA2退火后的雙鏈DNA(dsDNA)連接。轉(zhuǎn)化篩選后的克隆經(jīng)測序分析顯示，sgRNA1和sgRNA2序列已經(jīng)正確插入載體中(圖1B、C)，提取質(zhì)粒后分別命名為TGFBI-exon3-sgRNA1和TGFBI-exon3-sgRNA2質(zhì)粒。

圖1 重組表達載體pX330-TGFBI-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of pX330-TGFBI-sgRNA Recombinant PlasmidA： 根據(jù)pX330測序得出的PX330示意圖及BbsⅠ酶切位點細節(jié)圖；B： sgRNA1已經(jīng)正確連入pX330載體，命名為TGFBI-exon3-sgRNA1質(zhì)粒；C： sgRNA2已經(jīng)正確連入pX330載體，命名為TGFBI-exon3-sgRNA2質(zhì)粒；以上結(jié)果通過snapgene_viewer_2.8.3軟件分析得到

2.2 細胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選

將所構(gòu)建的2個質(zhì)粒以及帶有puro抗性的pGX-puro質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入HSC-3細胞中，2d后，根據(jù)質(zhì)粒上自帶的EGFP觀察轉(zhuǎn)染效率，雖然轉(zhuǎn)染效率較低，但的確有部分細胞轉(zhuǎn)染成功(圖2A)。用嘌呤霉素篩選挑選6個細胞克隆，提取DNA，PCR后將產(chǎn)物進行核酸電泳，發(fā)現(xiàn)6號克隆相對于其他克隆出現(xiàn)了部分核苷酸片段的缺失(圖2B)，割膠回收測序發(fā)現(xiàn)6號克隆有290個堿基的缺失包括整個外顯子3的核苷酸序列(圖2C)。根據(jù)條帶大小初步確定克隆6為TGFBI敲除細胞克隆命名為HSC-3-TGFBI-KO。

圖2 細胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選Fig.2 Cell transfection and screening of the stably transfected cell linesA： 暗場中少量細胞攜帶綠色熒光，顯示轉(zhuǎn)染成功；B： 挑選細胞克隆的DNA的核酸電泳圖顯示6號克隆有片段缺失，并將6號克隆命名為HSC-3-TGFBI-KO；C： 測序顯示HSC-3-TGFBI-KO相對于HSC-3有290個堿基的缺失，包括整個外顯子3序列；圖中紅色為sgRNA序列，藍色為外顯子3序列，紅色下劃線標(biāo)注為PAM序列，“-”標(biāo)注為缺失序列

2.3 穩(wěn)定基因敲除細胞株的TGFBI表達檢測

將得到的TGFBI穩(wěn)定敲除細胞培養(yǎng)后提取mRNA和蛋白，通過實時熒光定量PCR和免疫印跡法發(fā)現(xiàn)，從mRNA水平上，相對于HSC-3細胞，TGFBI穩(wěn)定敲除細胞HSC-3-TGFBI-KO的TGFBI表達已經(jīng)有了大幅度的下調(diào)(P<0.001)，而在蛋白水平上，幾乎無法在HSC-3-TGFBI-KO上檢測TGFBI的表達。結(jié)果說明HSC-3細胞TGFBI基因敲除細胞構(gòu)建是成功的。

2.4 TGFBI敲除引起的相關(guān)基因表達改變

通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)TGFBI敲出后，引起細胞增殖相關(guān)的核抗原Ki-67,細胞周期蛋白依懶性激酶1、2、4(CDK1、CDK2、CDK4)，細胞周期蛋白A、B(CCNA、CCNB)，神經(jīng)性鈣黏附素(N-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)的表達下調(diào)以及鈣黏附蛋白E(E-cadherin)，周期蛋白D1、E(CCND1、CCNE)表達上調(diào)(P<0.05)。

圖3 穩(wěn)定基因敲除細胞株的TGFBI表達檢測Fig.3 Detection of TGFBI expression in the stable knockout cell lineA： RT-qPCR顯示HSC-3-TGFBI-KO的TGFBI的mRNA表達有了大幅度的下調(diào),*P<0.001；B： 免疫印跡法顯示在HSC-3-TGFBI-KO細胞中無法檢測到TGFBI蛋白的表達

圖4 通過RT-qPCR檢測TGFBI敲除而引起的部分基因表達改變Fig.4 Detection of the altered genes induced by TGFBI knockout shown by RT-qPCR結(jié)果顯示Ki-67、CDK1、CDK2、CDK4、CCNA、CCNB、N-cadherin和Vimentin基因表達下調(diào)，而E-cadherin、CCND1和CCNE表達上升；與HSC-3組相比，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

OSCC屬于上皮源性腫瘤范圍，其癌變過程復(fù)雜，屬于多階段發(fā)生的過程，其整個病變過程是受到多種基因調(diào)控而完成[7]。隨著近年來細胞分子生物學(xué)的研究進展，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活相關(guān)，細胞的生長、分化和凋亡受到一系列基因的調(diào)控，這些基因的序列或表達的變化都會引起組織的生長失控及腫瘤的產(chǎn)生[8-9]。在本課題組前期研究中，通過生物信息學(xué)薈萃分析及免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)了TGFBI在OSCC患者中表達升高[2]。轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)的基因(transforming growth factor-β induced, TGFBI)又被稱為BGH3，BIGH3，其蛋白由683個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為68000，其氨基端為4段肽鏈組成的同源序列FAS1蛋白功能域；羧基端為精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸組成的RGD模體。TGFBI作為連接整合素與細胞外基質(zhì)蛋白比如膠原蛋白，層粘連蛋白，纖維連結(jié)蛋白的連接蛋白，在胚胎發(fā)育、細胞增殖、黏附、遷移、分化和炎癥發(fā)生中起著一定的作用[3,10,11]。已有文章報道TGFBI作為一個細胞外基質(zhì)蛋白在結(jié)腸癌，食管癌[12]，乳腺癌[13]等腫瘤中異常表達并對腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系。本次研究希望能構(gòu)建能用于研究TGFBI和OSCC之間作用的細胞工具。

CRISPR(clustered regularly interspersed short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系統(tǒng)廣泛存在于微生物界中，比如在細菌中和古生菌[14]。2012年學(xué)者在體外實驗中發(fā)現(xiàn)證實了Cas9蛋白可以與靶向的DNA位點結(jié)合起到DNA剪切的作用以來，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)獲得了重大的發(fā)展[15]。Cas9能與特異性的sgRNA形成cas9-sgRNA復(fù)合物，靶向目的基因，對其DNA實現(xiàn)特異性的剪切，并進行非同源末端連接修復(fù)過程中發(fā)生替換、移碼、插入或缺失，最終得到基因敲除或失活的目的[16]。與之前主流的基因編輯工具如鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對于載體的構(gòu)建和基因的編輯更為方便，更有針對性。另外，與siRNA，shRNA等基因沉默方法相比，CRISPR/Cas9技術(shù)對于基因的敲除效果更加穩(wěn)定和徹底[17]。

本次研究利用了CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了TGFBI穩(wěn)定敲除的HSC-3細胞系。為此設(shè)計了針對TGFBI外顯子3上下游的2個sgRNA，以PX330為載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)入HSC-3細胞中。從得到的HSC-3-TGFBI-KO細胞中發(fā)現(xiàn)，TGFBI的整個外顯子3序列已被敲除，同時，在mRNA水平上，TGFBI已經(jīng)有了非常大幅度的下調(diào)，而通過免疫印跡法發(fā)現(xiàn)HSC-3-TGFBI-KO細胞中已經(jīng)幾乎無法檢測到TGFBI蛋白的表達。這些結(jié)果表明，構(gòu)建的TGFBI穩(wěn)定敲除細胞系是成功的。通過RT-qPCR檢測HSC-3-TGFBI-KO和HSC-3細胞中的部分基因表達情況，本研究發(fā)現(xiàn)TGFBI敲除后，部分細胞周期蛋白(Cyclin)及周期蛋白依賴性激酶(CDK)表達發(fā)生了改變,細胞增殖相關(guān)的核抗原Ki-67基因也發(fā)生了一定程度的下調(diào)，同時神經(jīng)性鈣黏附素、波形蛋白、鈣粘附蛋白E等基因也發(fā)生了一定程度的改變。周期蛋白及其相關(guān)依賴性激酶在細胞周期調(diào)控中起到重要作用[18]，而神經(jīng)性鈣黏附素，波形蛋白，鈣粘附蛋白E等則在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中起到重要作用[19-20]。通過以上的實驗，本課題組初步猜測TGFBI的異常升高可能會通過細胞周期及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控來影響OSCC的發(fā)生發(fā)展。

總之，本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了TGFBI穩(wěn)定敲除的HSC-3細胞，為進一步研究TGFBI在OSCC發(fā)生發(fā)展的作用及其機制研究奠定了基礎(chǔ)。

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