范華宇， 龔 瑜， 于 倩， 史玉玲

(同濟大學附屬第十人民醫(yī)院皮膚科，上海 200072)

銀屑病(psoriasis)是免疫介導的多基因遺傳性皮膚病，環(huán)境因素在誘導銀屑病發(fā)病中起著重要的作用。CD4+T細胞在免疫系統(tǒng)中起主要的作用，在銀屑病的發(fā)病機制中也是關鍵因素，細胞因子和免疫細胞相互用導致角質形成細胞增生，表皮增厚，是銀屑病的主要發(fā)病機制[1]。IL-21是一種四螺旋束細胞因子，屬于IL-2細胞因子家族，主要由激活的CD4+T細胞、Th17細胞和NKT細胞分泌[2-3]。白細胞介素-21受體(interleukin-21 receptor, IL-21R)在很多免疫細胞和非免疫細胞表面均有表達,IL-21通過IL-21R和常見的細胞因子受體γc鏈發(fā)揮信號作用[4]。研究結果表明，IL-21及IL-21R和銀屑病發(fā)病密切相關，本研究旨在研究IL-21及IL-21R在銀屑病發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 血液標本 58例尋常型銀屑病患者外周血標本取自同濟大學附屬第十人民醫(yī)院皮膚科門診和病房，所有病例均符合銀屑病的診斷標準。納入標準： 銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)(psoriasis area and serverity index, PASI)≥10以及皮損面積>10%中、重度銀屑病的患者；所有患者入組前1個月內未接受過系統(tǒng)治療，2周內未外用銀屑病治療藥物。排除標準： 有嚴重感染和免疫抑制的患者；合并有肝、腎及其他嚴重疾病的患者；妊娠及哺乳期婦女。健康對照組20例，均為健康成人獻血員。所有患者和健康對照者均簽署知情同意書。血液標本用來提取PBMCs細胞進行相關實驗。

1.1.2 組織標本 選取其中25例銀屑病患者進行皮膚組織病理檢查，15例正常對照組的皮膚來自整形外科手術腰背部正常皮膚。組織標本用來抽提RNA和蛋白進行實驗。

1.2 主要試劑

流式相關抗體均來自eBioscience公司；總RNA提取液RNAisoTMPlus、反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq均購自寶生物工程(大連)有限公司；IL-21 ELISA試劑盒購自美國RD公司；淋巴細胞分離液、RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清均來自奧地利PAA Laboratories GmbH公司；PMA和伊屋諾霉素購自美國Sigma-Aldrich公司；兔多克隆IL-21抗體購自美國Novus Biologicals公司；兔多克隆IL-21受體抗體購自英國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 PBMC的分離 用EDTA抗凝管采集研究對象5mL血液，用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法獲得PBMC。將PBMC平均分裝2個1.5mL的EP管，一部分用于抽提RNA，另一部分用于IL-21R和細胞培養(yǎng)刺激5h后IL-21等細胞因子的檢測。

1.3.2 PBMC中IL-21、IL-21R的流式檢測 用含10%胎牛血清的1640細胞培養(yǎng)液將PBMC重懸，計數(shù)，將PBMC的濃度調整到2×106/mL，總體積為500μL。用96孔U型培養(yǎng)板作細胞培養(yǎng)，將500μL細胞懸液加入2孔中，每孔PBMC為1×106，其中一孔加入50ng/mL PMA，500ng/mL伊屋諾霉素和2.5μL Brefeldin，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5h后進行免疫熒光抗體的標記；室溫避光表面染色CD4-FITC 15min；1mL PBS洗滌1次，每管加入100μL固定液室溫避光30min；1mL穿膜液洗滌2次，每管加入100μL穿膜液和IL-21-Alexa Fluor?647，同型對照管加入Isotype Control-Alexa Fluor?647，震蕩混勻，避光室溫20min；1mL穿膜液洗滌細胞后用300μL流式染色緩沖液重懸細胞，上流式細胞儀檢測，使用CELLQuest軟件收獲細胞并檢測。

1.3.3 PBMC中IL-21R的流式檢測 將每管PBMC調整到1×106PBMC，分別加入CD4-FITC、IL-21R-PE，室溫避光表面染色15min；1mL PBS洗滌細胞后用300μL流式染色Buffer重懸細胞，上流式細胞儀檢測。首先圈出CD4+的淋巴細胞，然后再從CD4+淋巴細胞中圈出CD4+IL-21R+的細胞。

1.3.4 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640細胞培養(yǎng)液將PBMC重懸，用96孔U型培養(yǎng)板作細胞培養(yǎng)，將500μL細胞懸液加入1孔中，PBMC數(shù)量為1×106，加入50ng/mL PMA、500ng/mL Ionomycin，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h，取上清液檢測IL-21水平。

1.3.5 PBMC RNA的抽提 向106個PBMC加入1mL RNAisoTMPlus后振蕩混勻，按照RNA抽提試劑盒說明進行，RNA沉淀常溫干燥后，加20μL DEPC水溶解。皮膚組織稱重量，TRIzol組織勻漿，按RNA抽提試劑盒進行抽提。取1.5μL在紫外分光光度計上測量RNA濃度，根據D260/D280的比值來估算核酸純度，正常值范圍為1.8～2.0。

1.3.6 反轉錄 參照TaKaRa公司反轉錄試劑盒說明書進行，按10μL的反應體系配制RT反應液(反應液的配制在冰上進行)： 總RNA為500ng，PrimeScript緩沖液2μL，PrimeScript RT酶混合I 0.5μL,Oligo dT Primer 0.5μL,Random 6 mers 0.5μL,余下的量用RNase Free dH2O補齊。

1.3.7 RT-PCR 本實驗所用的引物，均由Invitrogen公司合成。實驗步驟參照TaKaRa公司SYBR green熒光定量PCR試劑盒說明書，具體步驟如下： 進行兩步法PCR擴增反應。預變性： 95℃ 30s，1個循環(huán)；PCR反應： 95℃ 5s，60℃ 20s，40個循環(huán)；解鏈： 95℃ 15s，60℃ 30s，95℃ 15s，1個循環(huán)。得到每個標本不同指標的Ct值，根據公式2-⊿⊿Ct計算出所測指標的相對表達量。

1.3.8 Western印跡法檢測IL-21和IL-21R在皮膚組織中的表達 (1) 蛋白質樣品制備： 利用液氮、研缽粉碎組織塊，加入裂解液，利用組織勻漿機進一步勻漿，移入離心管，4℃ 12000r/min，離心10min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度并校準不同樣品的蛋白濃度。(2) 常規(guī)蛋白電泳： SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，室溫避光封閉2h，相應一抗4℃孵育過夜，膜漂洗3次后，二抗室溫孵育2h，應用ECL顯色試劑盒顯色。

1.3.9 IL-21、IL-21R的ELISA測定 采集靜脈血5mL,以3000r/min，離心15min后取上清液。PBMC培養(yǎng)5h后取上清液，均于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書建立標準曲線，樣品加樣，酶標儀測定450nm處D450值，根據標準曲線讀取樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 CD4+IL-21+細胞和CD4+IL-21R+細胞在銀屑病患者PBMC中的表達

銀屑病患者外周血PBMC中CD4+IL-21+細胞百分率較健康對照組有顯著升高[銀屑病組(4.14±1.23)%，健康對照組(1.82±0.64)%，P<0.01)，CD4+IL-21R+細胞較健康對照組亦有顯著升高[銀屑病組(2.37±0.79)%，健康對照組(1.57±0.54)%，P<0.01]，見圖1。

圖1 CD4+IL-21+細胞和CD4+IL-21R+細胞在銀屑病外周血PBMC中的比例Fig.1 The ratio of CD4+IL-21+ cells and CD4+IL-21R+ cells in peripheral blood of psoriasis patientsA： 銀屑病患者和健康對照組PBMC中IL-21+細胞和IL-21R+細胞流式細胞儀散點圖；B： 統(tǒng)計學分析，與對照組相比，*P<0.01

2.2 IL-21、IL-21R mRNA在銀屑病患者PBMC中的表達

58例銀屑病患者及20例健康對照人群的PBMC中IL-21 mRNA的相對表達量分別為5.14±2.49和2.54±1.01；IL-21R mRNA的相對表達量分別為3.55±2.04和2.59±0.79。銀屑病患者外周血PBMC中IL-21、IL-21R表達水平均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)。

2.3 IL-21、IL-21R mRNA在銀屑病患者組織中的表達

RT-PCR檢測25例銀屑病患者皮損組織和15例正常對照者皮膚組織中IL-21 mRNA、IL-21R mRNA的表達。銀屑病患者和正常對照皮膚組織中IL-21 mRNA的相對表達量分別為12.4±4.56和3.59±1.29；IL-21R mRNA的相對表達量分別為5.35±2.28和2.59±0.85。銀屑病患者皮膚組織中IL-21、IL-21R表達水平均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 健康對照組和銀屑病患者皮膚組織中IL-21和IL-21R mRNA的表達水平Fig.2 The mRNA expression of IL-21 and IL-21R in skin tissues of psoriasis patients and healthy controls與對照組比較，*P<0.01

2.4 銀屑病患者皮膚組織中IL-21、IL-21R的蛋白表達水平

Western印跡法檢測25例銀屑病患者皮損組織和15例正常對照者皮膚組織中IL-21、IL-21R蛋白的表達。Western印跡法結果顯示，銀屑病患者和正常對照皮膚組織相比IL-21、IL-21R蛋白表達水平明顯升高，見圖3。

圖3 Western印跡法檢測銀屑病患者和正常對照皮膚組織中IL-21、IL-21R蛋白表達差異Fig.3 The protein expression of IL-21 and IL-21R in skin tissues of psoriasis patients and healthy controls detected by Western blotting

2.5 銀屑病患者PBMC培養(yǎng)上清中IL-21水平

銀屑病患者PBMC分泌IL-21的水平為(159.35±15.15)ng/L，明顯高于正常對照組的(67.76±12.08)ng/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討 論

銀屑病是在多基因遺傳背景下由T細胞介導的炎癥性皮膚病，以角質形成細胞過度增殖和異常分化及炎性細胞浸潤為主要特征[5]。真皮內的CD4+T細胞及其產生的細胞因子是銀屑病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，表皮角質形成細胞的增殖只是免疫學反應繼發(fā)結果之一[6]。因此，探索細胞因子在銀屑病發(fā)病中的作用對于探討有效的治療方法有著重要的意義。

人類IL-21基因位于染色體4q26-q27上[2]，IL-21通過IL-21R及γc鏈發(fā)揮信號轉導作用。γc鏈是IL-21R復合體的組成部分，IL-21通過IL-21R/γc鏈激活JAK1、JAK3、STAT1、STAT3通路[7]。在γc鏈缺失的情況下IL-21可以和IL-21R結合，但是細胞內的信號轉導只有在γc鏈存在的情況下才能進行[2]。IL-21R產生的信號誘導調節(jié)性B細胞(B10細胞)擴增和IL-10分泌，因此人和鼠B10細胞能通過IL-21的交互認知調控T細胞自身免疫[8]。IL-21有促進淋巴細胞增生的功能，增加CD8+T細胞和NK細胞的毒性，并直接抑制樹突狀細胞的抗原提呈作用[9]。有研究在Ⅰ型糖尿病的模型中發(fā)現(xiàn)，在體內和體外T-bet缺乏均導致IL-21依賴的CD8+T細胞細胞毒性的缺陷，因此，IL-21通過轉錄因子T-bet的作用驅動CD8+CTL的分化[10]。IL-21對NK細胞的生長和功能有多重效果，能通過上調IFN-γ和顆粒酶B，濃度依賴性的增強NK細胞的細胞毒性作用。在體內實驗中，IL-21促進NK細胞和CD8+T細胞產生更多的穿孔素和顆粒酶B，增強細胞毒性作用[11]。IL-21能促進IL-23R的表達，增加IL-23的細胞應答。IL-21雖然可以在體外促進Th17細胞的分化，但在過敏性腦炎模型中，Th17細胞的發(fā)展在WT和IL-21r敲除的小鼠中并沒有差別[12]。也有研究報道IL-21可以增加γδT細胞產生的IL-17[13]。IL-21可抑制Treg細胞的功能，并且在Treg細胞缺失的情況下，IL-21促進炎癥性疾病的發(fā)生[14]。Tfh細胞分泌IL-21，IL-21促進Tfh的分化[15]，但IL-21對于Tfh細胞和Th17細胞的發(fā)展不是必需的[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-21參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生，如系統(tǒng)性硬化、類風濕性關節(jié)炎(RA)、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病等。在系統(tǒng)性硬化的皮膚組織和RA患者的關節(jié)滑膜組織內，IL-21R mRNA的表達顯著升高，RA患者IL-21R陽性細胞高表達在滑膜侵入關節(jié)軟骨和骨的部位，尤其在滑膜組織內的巨噬細胞和成纖維細胞[16]。研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者的皮損中IL-21蛋白和mRNA均明顯高于同一患者的非皮損和正常人。銀屑病患者血清中IL-21的水平較正常對照組血清中IL-21的水平升高，并和PASI評分呈正相關。關于Ustekinumab治療銀屑病的可能靶點研究顯示，對該單抗治療反應不敏感的患者和敏感患者相比較，反應敏感患者皮損部位的IL-20，IL-21，P40的mRNA水平顯著下調[18]。在嚴重免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)的真皮內注射重組IL-21以及Th1、Th17炎性細胞可以誘導出銀屑病樣皮損，在SCID小鼠的移植皮損中注射IL-21的抗體，移植皮損有所好轉?？梢姡琁L-21在銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。綜上所述，IL-21能促使多種免疫細胞分泌炎癥因子，增強細胞毒性細胞的殺傷作用，在免疫機制中發(fā)揮著多種作用。

本研究證實在銀屑病患者外周血和皮損中存在IL-21和IL-21R，其水平明顯高于正常對照組，可見IL-21和IL-21R在銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用，為探索IL-21在銀屑病中發(fā)病中的作用提供了理論依據，將來IL-21有望成為治療性細胞因子用于銀屑病治療。

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