施劍春 劉 青 鄧衛(wèi)東

（1.大理市畜牧工作站，云南大理 671000； 2.彌渡縣彌城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，云南彌渡 675600；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動科院，云南昆明 650201）

小反芻獸疫（paste debs pests ruminants，PPR）俗稱羊瘟，又名小反芻獸假性牛瘟（pseudo rinderpest）、肺腸（gastroenteritis）、口炎肺腸炎復(fù)合癥（gastro-enteritis complex），是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性病毒性傳染病。在自然條件下主要感染綿羊、山羊和美國白尾鹿等小反芻動物，主要感染小反芻動物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征。該病作為一種重大的跨國界傳播性動物疫病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動物疫病，在我國被列為一類動物疫病，PPR 主要通過直接接觸傳染，患病動物的排泄物和分泌物是主要傳染源，尤其是感染后隱蔽帶毒的羊更為危險(xiǎn)。易感動物發(fā)病率可達(dá)100%，嚴(yán)重暴發(fā)時(shí)，死亡率可達(dá)100%。我國在2007年首次在西藏發(fā)現(xiàn)該病以來，先后在新疆、貴州、湖南以及黑龍江等地暴發(fā)流行，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)羊業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，2014年4月，云南首次暴發(fā)PPR疫情。該病是OIE 法定報(bào)告動物疫病，也是全球計(jì)劃根除的動物疫病?！秶抑虚L期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》將PPR 列為重點(diǎn)防范的外來動物疫病，并擬在2016～2020 年間根除該疫病。目前，該病尚無有效治療方法，主要通過早期診斷和疫苗免疫進(jìn)行控制。

老君山鎮(zhèn)位于劍川縣西北部，東依老君山，西靠雪斑山，南鄰馬登鎮(zhèn)，北與怒江蘭坪縣相連，是大理州和劍川縣對外交往的一個(gè)重要“窗口”。老君山鎮(zhèn)面積238km2，鄉(xiāng)政府駐富樂村，海拔2450m，年均溫10℃，年均降水量960mm。直距金華鎮(zhèn)32km，轄10個(gè)行政村、31個(gè)自然村，有白、彝、傈僳等民族。畜牧業(yè)除了主要以生豬、家禽、黃牛養(yǎng)殖為主以外，還有一種地方稀有物種資源—烏骨羊，2017年全鎮(zhèn)烏骨羊存欄約1200只，市場價(jià)平均4000～5000元/只，若有疫情發(fā)生，會給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)，世界各國對畜禽遺傳資源的保護(hù)與開發(fā)利用均給予了高度重視，因此，特開展此次烏骨羊小反芻獸疫免疫效果評價(jià)調(diào)查，用阻斷ELISA方法檢測小反芻獸疫抗體[11-12]，為切實(shí)掌握與評估老君山鎮(zhèn)烏骨羊小反芻獸疫免疫效果和制定防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗與檢測劑

小反芻獸疫疫苗是新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的PPR 弱毒活疫苗，批準(zhǔn)文號：獸藥生字（2016）310014026；檢測試劑為中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心（青島）提供的小反芻獸疫阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒，批號為：201709。

1.2 試驗(yàn)動物

2017年5月和11月分別抽取劍川縣君山鎮(zhèn)轄區(qū)內(nèi)臨床無小反芻獸疫癥狀且已經(jīng)免疫過小反芻獸疫疫苗的4個(gè)養(yǎng)殖場共240份健康烏骨羊血清（其中烏骨綿羊128份、烏骨山羊112份），離心分離血清，編號待檢，-20℃保存。兩次采集的羊只固定不變，血清抗體檢測期間試驗(yàn)動物不對外出售。

1.3 儀器

單道移液器、多道移液器、生化培養(yǎng)箱、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、普通離心機(jī)、一次性移液器吸頭等均由云南省動物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 試驗(yàn)方法

用阻斷ELISA抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

① 在A1 和B1 抗原包被孔中加入陽性血清50μl/孔，在C1和D1抗原包被孔中加入陰性血清50μl/孔，在E1和F1 抗原包被孔中加入稀釋液50μl/孔，在樣品孔中加入稀釋液25μl/孔，在樣品孔中再加入分別對應(yīng)的待檢血清25μl/孔。

② 37℃孵育60 min。

③ 棄去反應(yīng)孔中的液體，每孔用洗滌液清洗4次，洗滌液（×1）300μl/ 孔，每次除去洗滌液后，在吸水紙上拍打，除去殘留的液體，最后一次拍干。

④ 加酶結(jié)合物按1∶5 倍稀釋酶標(biāo)單抗，每孔加50μl/孔，37℃孵育30 min。

⑤ 重復(fù)步驟③。

⑥ 每孔加底物溶液50μl，室溫避光10～15 min。

⑦ 每孔加終止液50μl，用酶標(biāo)儀在450 NM 波長下測定各孔OD450NM值。

1.5 結(jié)果判定

當(dāng)陽性對照阻斷率（PB）大于60，陰性對照阻斷率（PB）小于或等于40，試驗(yàn)有效。計(jì)算待檢樣品阻斷率（PB），待檢樣品阻斷率（PB）大于50 判為陽性，小于等于50 則判為陰性。統(tǒng)計(jì)陽性樣品數(shù)即為免疫合格數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 血清抗體檢測結(jié)果

（1）兩次檢測都是采集了固定不變的240只相同的烏骨羊的血清，其中第一次（免疫后6個(gè)月）抗體陽性量222份，平均陽性率92.5%；第二次（免疫后12個(gè)月）抗體陽性量210份，平均陽性率87.5%（見表1）。

（2）同一次檢測結(jié)果顯示，不同品種血清抗體平均陽性率差不多，其中免疫后6個(gè)月的烏骨綿羊平均陽性抗體率92.19%，烏骨山羊平均陽性抗體率92.86%；免疫后12個(gè)月的烏骨綿羊平均陽性抗體率85.94%，烏骨山羊平均陽性抗體率89.29%（見表1）。

表1 小反芻獸疫血清抗體檢測結(jié)果 只、%

2.2 免疫效果調(diào)查

2.2.1 疫情調(diào)查

免疫前，檢測所采集的240只烏骨羊群，均未出現(xiàn)疑似小反芻獸疫臨床癥狀，免疫后至今，轄區(qū)內(nèi)也未發(fā)生疑似小反芻獸疫病例。

2.2.2 不良反應(yīng)調(diào)查

240只羊群，在接種小反芻獸疫疫苗24h后未出現(xiàn)不采食等不良現(xiàn)狀，抽測20只羊的體溫位38.4℃～39.2℃之間，體溫正常；免疫24d后均未出現(xiàn)流產(chǎn)、死亡的現(xiàn)象。

3 結(jié)果分析

檢測結(jié)果顯示，不同品種不同檢測時(shí)間的血清抗體陽性率都在70%以上，達(dá)到國家規(guī)定的大于70%]的標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查結(jié)果顯示免疫后免疫羊群未出現(xiàn)疑似小反芻獸疫病例，無不良反應(yīng)，由此可以推斷全鎮(zhèn)烏骨羊小反芻獸疫疫苗效果比較良好，適應(yīng)強(qiáng)，副作用小。小反芻獸疫抗體可持續(xù)時(shí)間長達(dá)12個(gè)月，后期情況還需進(jìn)一步觀察，關(guān)鍵是必須對免疫后的羊群定期進(jìn)行采樣監(jiān)測，根據(jù)免疫抗體的消長水平來確定免疫時(shí)間。

4 討論

（1）從兩次檢測結(jié)果來看，發(fā)現(xiàn)小反芻獸疫血清抗體合格率都達(dá)到了國家農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局提出抗體合格率不低于70%的要求，說明免疫效果整體較好，基本上構(gòu)建了有效的免疫屏障。

（2）本次使用新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司的PPR 活疫苗對本轄區(qū)內(nèi)的健康烏骨羊只進(jìn)行免疫接種，接種后未見PPR新病例和不良接種反應(yīng)，表明PPR 活疫苗的副作用小，免疫效果好，安全可靠。

（3）從中可以發(fā)現(xiàn)近年來當(dāng)?shù)卣托竽莲F醫(yī)主管部門對動物疫病防控方面比較重視，結(jié)合本地區(qū)和周邊動物疫病流行情況制定科學(xué)有效的免疫方案，宣傳比較到位，切實(shí)做好動物疫病防控工作；防疫人員能夠按照免疫注意事項(xiàng)就行免疫操作，操作水平較高；養(yǎng)殖場管理人員的依法防疫、自覺防疫意識強(qiáng)，積極配合主管部門開展好轄區(qū)內(nèi)的動物疫病防控工作，同時(shí)還反映出飼養(yǎng)環(huán)境和管理水平等能夠跟得上規(guī)?；B(yǎng)殖的要求。

（4）從羊群品種來說，烏骨山羊的免疫抗體平均轉(zhuǎn)陽率比烏骨綿羊稍微高一些，目前推測可能是烏骨山羊?qū)PR病毒易感性較高所致。根據(jù)有關(guān)報(bào)道指出，山羊注射PPR疫苗后產(chǎn)生的抗體效果要顯著高于綿羊。因此，不同羊群品種注射疫苗后所表現(xiàn)出來的免疫應(yīng)答效果也不盡相同。

參考文獻(xiàn)

[1]李佳，何宗霖，白正輝，等.新疆阿克蘇地區(qū)羊小反芻獸疫免疫效果檢測與分析[J].草食家畜，2015，（4）：49-51.

[2]李彥芳，玉蘇甫，溫倩木，等.小反芻獸疫疫苗免疫效果評價(jià)[J].中國畜牧業(yè)，2014，（12）：62-63.

[3]周莉媛，張毅，邵靚，等.四川省2016小反芻獸疫免疫抗體監(jiān)測與分析[J].四川畜牧獸醫(yī)，2017，320（4）：30-31.

[4]王樂元，次真，吳國珍，等.中國西藏小反芻獸疫的發(fā)生狀況與防控[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（5）：717-720.

[5]車小蛟，郭慧琳，何彥春，等.張掖市小反芻獸疫免疫效果檢測與分析[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志，2015，（11）：11-13.

[6]宋紅蓮，徐陽，孔邵國，等.易門縣小反芻獸疫免疫效果的調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2015，31（5）：118-119.

[7]謝欣妤，盧旭疇，莫鉆蘭，等.東莞市羊小反芻獸疫抗體血清學(xué)調(diào)查[J].畜禽業(yè)，2017，（7）：85-86.

[8]侯佳福.地方珍稀羊種——蘭坪烏骨羊[J].農(nóng)家科技，2010，（10）：7.

[9]李靜靜，馬杰，傳衛(wèi)軍，等.小反芻獸疫免疫抗體的檢測與分析[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（10）：81.

[10]呂嶸，楊耀蘭，羅曉燕，等．玉溪市小反芻獸疫疫苗臨床免疫效果評估[J]．畜牧與獸醫(yī)，2016，48（6）：123-125.