周曉惠 張軍東

摘 要 目的：建立鹽酸利多卡因眼用凝膠中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。方法：按照中國藥典2015版四部 1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，確定鹽酸利多卡因眼用凝膠的有效稀釋濃度和細(xì)菌內(nèi)毒素限值。結(jié)果：鹽酸利多卡因眼用凝膠經(jīng)稀釋4倍后不干擾鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)，其細(xì)菌內(nèi)毒素均小于0.5 EU/ml。結(jié)論：本研究的方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于鹽酸利多卡因眼用凝膠中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

關(guān)鍵詞 利多卡因眼用凝膠 細(xì)菌內(nèi)毒素 鱟試劑

中圖分類號：R944.15； R927.11 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533（2018）05-0073-04

Validation of the methods for testing bacterial endotoxin in lidocaine hydrochloride ophthalmic gel

ZHOU Xiaohui*， ZHANG Jundong

（Shanghai Haohai Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the detection of bacterial endotoxins in lidocaine hydrochloride ophthalmic gel. Methods： The valid dilution concentration and limit value of the gel for the detection of bacterial endotoxin were tested based on the Chinese pharmacopoeia 2015 edition （Volume 4）. Results： The gel sample with 4-fold dilution would not interfere with the agglutination reaction between tachypleus amebocyte lysate and bacterial endotoxins and the values of bacterial endotoxin were all less than 0.5 EU/ml. Conclusion： The established method is simple， rapid， reliable and feasible for the detection of the bacterial endotoxins in lidocaine hydrochloride ophthalmic gel.

KEY WORDS lidocaine hydrochloride ophthalmic gel； bacterial endotoxins； tachypleus amebocyte lysate

鹽酸利多卡因?yàn)轷０奉惵樽硭?，臨床上已使用多年。將鹽酸利多卡因制成眼用凝膠為新型眼表麻醉用藥，起效快，眼部停留時(shí)間長，在眼科手術(shù)上有重要用途。為保證藥品質(zhì)量，降低使用風(fēng)險(xiǎn)，本研究參考中國藥典2015年版四部1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1]及文獻(xiàn)[2-4]建立了鱟試劑檢查眼用凝膠的方法，簡便可行，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器

Eppendorf微量取液器（50～1 000 ml）；QL-901型漩渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）； LRH-70生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用具（廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠）。

1.2 藥品與試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠，批號160702，每支2 ml）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠，批號160301，每支15 EU）；鱟試劑（廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠，批號160306，靈敏度0.125 EU/ml）；鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號1511202，靈敏度0.125 EU/ml）；眼用凝膠（上海昊海生科自制，批號160101、160102、160103，規(guī)格5 ml/支）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

參照中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY0861-2011眼科光學(xué)眼用粘彈劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值為0.5 EU/ml[5]和《中國藥典》2015年版（四部）附錄0128沖洗劑細(xì)菌內(nèi)毒素限制為0.5 EU/ml[1]，確定本品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值為0.5 EU/ml。

1.3.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在漩渦混合器上混勻15 min，然后稀釋成2.0，1.0，0.5，0.25 λ（λ靈敏度標(biāo)示值）4個(gè)濃度等級，按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1]進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn)，靈敏度測定值λc均在0.5～2.0 λ之間，符合規(guī)定。

1.3.3 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根據(jù)公式MVD=cL/λ[5]，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值即0.5 EU/ml；c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則c等于1.0 mg/ml；λ為主凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，目前市售鱟試劑的λ通常為0.5 EU/ml，0.25 EU/ml，0.125 EU/ml，0.06 EU/ml，0.03 EU/ml，故鹽酸利多卡因眼凝膠的MVD分別為1、2、4、8和16倍。

1.3.4 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)

將眼用凝膠用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋成1、2、4、8和16倍的溶液，測定pH值在6.0～7.0范圍內(nèi)，符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的pH值要求，作為供試品陰性對照（NPC）系列。另制備同樣濃度的供試品系列溶液，使每一濃度的供試品溶液中都含有2 λ內(nèi)毒素，作為供試品陽性對照（PPC）系列。用來自2個(gè)廠家靈敏度均為0.125 EU/ml的鱟試劑與上述NPC和PPC系列溶液進(jìn)行反應(yīng)，每一供試品濃度平行兩管，按常規(guī)設(shè)立陽性對照（PC）管和陰性對照（NC）管，混勻后封口，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)60 min。

1.3.5 干擾試驗(yàn)

為了最終確認(rèn)是否存在抑制因素的影響，進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。取3批眼用凝膠用BET水分別稀釋為若干倍稀釋液，用該稀釋液和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，配成細(xì)菌內(nèi)毒素最終濃度分別為0.25（2 λ）、0.125（λ）、0.062 5（0.5 λ）、0.031 25（0.25 λ）EU/ml的系列溶液，與2個(gè)廠家的靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑反應(yīng)，每個(gè)濃度平行做4管，另取供試品溶液平行2支，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照，依法進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

1.3.6 樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取3批眼用凝膠按規(guī)定倍數(shù)稀釋，使用2個(gè)廠家靈敏度λ為0.125 EU/ml的鱟試劑，按中國藥典2015年版（四部）附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查。

2 結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

對2個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核，經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品檢測λc在0.5 ～2.0 λ之間，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，可用于試驗(yàn)（表1）。

2.2 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

眼用凝膠對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素之間的聚集反應(yīng)無干擾，考慮到原液為凝膠狀，用微量移液器無法準(zhǔn)確吸取，稀釋4倍后可準(zhǔn)確吸取，因此選擇稀釋4倍為最終稀釋倍數(shù)。結(jié)果見表2。

2.3 干擾試驗(yàn)

兩個(gè)廠家鱟試劑的Es均在0.5～2.0 λ（包括0.5 λ和2.0 λ）之間，且Et在0.5～2.0 Es（包括0.5 Es和2.0 Es）的范圍內(nèi)（Es為用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，Et為用供試品溶液制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值），表明稀釋4倍的供試品溶液對試驗(yàn)無干擾，可在低于或等于此濃度的情況下使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（表3）。

2.4 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果

3批眼用凝膠樣品稀釋4倍后進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，結(jié)果表明，3批樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測均小于0.5 EU/ml，符合規(guī)定（表4）。

3 討論

眼用凝膠稀釋后pH為6.0～7.0，符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查供試液pH 要求標(biāo)準(zhǔn)，不干擾凝膠反應(yīng)，無需調(diào)節(jié)可直接取供試品用BET 水稀釋。

干擾初篩試驗(yàn)的目的是初步篩選出對檢查無干擾的樣品稀釋倍數(shù)范圍及相應(yīng)的鱟試劑靈敏度，最終要經(jīng)干擾試驗(yàn)驗(yàn)證，從表2結(jié)果初步判斷樣品2～16倍稀釋液對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用.理論上可選擇樣品2、4、8、16倍稀釋液中的任一溶液，采用相應(yīng)靈敏度的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)，為了簡化樣品的稀釋操作步驟并使稀釋液能被準(zhǔn)確量取，本試驗(yàn)選擇稀釋倍數(shù)為4，用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行干擾確證試驗(yàn)。

表3干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示，3批樣品經(jīng)稀釋4倍后，分別使用兩個(gè)不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑（靈敏度均為0.125 EU/ml）進(jìn)行試驗(yàn)，其Et/Es均在0.5～2.0之間，按照中國藥典附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗(yàn)項(xiàng)下的判斷標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為樣品在該稀釋倍數(shù)下不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查.

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定眼用凝膠細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法如下：將本品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋4倍，依據(jù)中國藥典[1]附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行檢查，細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為0.5 EU/ml.

參考文獻(xiàn)

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