陳尚龍，劉輝，張建萍，*，戴意強，魏云

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州221018；2.徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇徐州221018）

Se是1種對人體健康有著重大意義的必需微量營養(yǎng)元素，它可以與人體內(nèi)一些酶結(jié)合形成具有很強抗氧化能力的物質(zhì)，從而增強人體的免疫力[1]。Se需要通過食物從外界攝入，平時食用的食物中Se含量極低，很難滿足人體正常需要，導(dǎo)致缺Se現(xiàn)象較為普遍，嚴重威脅人體健康[2-3]。如何科學(xué)地補Se已成為研究熱點。近年來，隨著對富硒產(chǎn)品功能研究的深入，已經(jīng)認識到高品質(zhì)富硒產(chǎn)品不僅取決于硒的含量，還與硒的形態(tài)有著密切關(guān)聯(lián)[4-8]。在人體內(nèi)不同形態(tài)的Se有著不同的化學(xué)行為和生物活性[9-10]。相關(guān)研究報告表明，無機硒不易被人體吸收，生物活性低，具有一定毒性，攝入不當(dāng)會引起慢性中毒；而經(jīng)過生物轉(zhuǎn)換的有機硒，易被人體吸收，毒性低，具有的生物學(xué)功能是由硒蛋白來調(diào)控和實現(xiàn)的[11-14]，因此與無機硒相比，有機硒更為重要。

本試驗以實驗室研制的富硒蛹蟲草為研究對象。首先，參照DBS42/002-2014《湖北省食品安全地方標準富有機硒食品硒含量要求》制備出富硒蛹蟲草總硒測定試樣；其次，參照GB 1903.21-2016《食品安全國家標準食品營養(yǎng)強化劑富硒酵母》制備出富硒蛹蟲草無機硒測定試樣；然后，再使用高分辨-連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜法（high resolution-continuum source graphite furnace atomic absorption spectrophotometry，HR-CSGFAAS）[15-23]進行測定；最后，根據(jù)“有機硒含量（mg/g）=總硒含量（mg/g）-無機硒含量（mg/g）”計算出富硒蛹蟲草中有機硒含量，為快速、準確檢測食品中微量元素含量及其形態(tài)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒蛹蟲草：江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室研發(fā)的樣品。

濃硝酸、高氯酸、φ（乙醇）=95%、Mg（NO3）2、Pd（NO3）2（均為優(yōu)級純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Se標準溶液（1 g/L）：國家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心；18.2MΩ·cm超純水；氬氣（純度大于99.99%）；玻璃器皿均用φ（HNO3）=5%溶液浸泡24 h以上。

1.2 儀器與設(shè)備

ContrAA 700高分辨連續(xù)光源原子吸收光譜儀（配有MPE60自動進樣器）：德國Analytik Jena公司；L550離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；CascadaTM實驗室超純水系統(tǒng)：美國Pall公司；FA-2004B電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；220V-AC電子電爐（0～2 000W）：上海樹立儀器儀表有限公司；移液器：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器工作參數(shù)

HR-CSGFAAS測定Se工作參數(shù)：分析譜線為196.026 7 nm，載氣為高純氬氣，基體改進劑為Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液，基體改進劑添加體積為5μL，進樣體積為20μL，灰化溫度為1 100℃，原子化溫度為2 200℃，原子化升溫速度為1 500℃/s。

1.3.2 基體改進劑溶液的配制

用 φ（HNO3）=0.5%溶液溶解 0.1 g Pd（NO3）2和0.05 g Mg（NO3）2后轉(zhuǎn)移至 100mL 容量瓶中，再用此溶液定容至刻度，配制成1 g/L Pd（NO3）2和0.5 g/L Mg（NO3）2混合溶液。

1.3.3 標準工作曲線的配制

用移液槍準確移取60μLSe標準溶液（1 g/L）置于100mL容量瓶中，再用φ（HNO3）=0.5%溶液定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.6mg/L的Se標準使用液，再通過MPE自動進樣器實現(xiàn)標準曲線質(zhì)量濃度梯度為 0.03、0.09、0.15、0.30、0.45、0.60mg/L。

1.3.4 樣品前處理

總硒測定試樣制備（參照DBS42/002-2014）：準確稱取0.5 g～2.0 g（精確至0.1mg）富硒蛹蟲草粉末試樣，置于150mL高筒燒杯內(nèi)，加10.0mL混合酸（硝酸與高氯酸按體積比4∶1混合）及幾粒玻璃珠，蓋上表面皿冷消化過夜。次日于電熱板上加熱，并及時補加混合酸。當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙時，再繼續(xù)加熱至剩余體積2mL左右，切不可蒸干。冷卻，再加5mL鹽酸（6mol/L），繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)，以完全將六價硒還原成四價硒。冷卻，轉(zhuǎn)移定容至50mL容量瓶中，同時做空白試驗。

無機硒測定試樣制備參照GB 1903.21-2016：準確稱取1 g左右（精確至0.1mg）富硒蛹蟲草粉末試樣，置于50mL小燒杯中，加入25mLφ（乙醇）=95%，在磁力攪拌器中攪拌30min，使試樣充分溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用φ（乙醇）=95%定容至刻度，振蕩、搖勻，靜置于冰箱1 h。將定容后的溶液置于4 000 r/min條件下離心30min。同時做空白試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 基體改進劑添加體積的優(yōu)化

試驗以 Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液為基體改進劑，基體改進劑的添加體積是影響Se吸光度的因素之一，為了最大限度地消除基體干擾，提高Se的吸光度。試驗在固定其他參數(shù)條件下，只改變基體改進劑的添加體積，測定Se的吸光度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 基體改進劑的體積對吸光度的影響Fig.1 Effectofm atrixm odifier volum eon absorbancy

由圖 1 可知，以 Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液為基體改進劑能顯著地提高Se的吸光度，這是由于不添加基體改進劑時，過高的灰化溫度會導(dǎo)致Se揮發(fā)損失，使Se的吸光度降低。當(dāng)添加體積＜5μL時，Se的吸光度隨著基體改進劑添加體積的增大而增大；當(dāng)體積≥5μL時，增加趨勢趨于平緩。因此，試驗選擇基體改進劑最佳添加體積為5μL。

2.2 灰化溫度的優(yōu)化

灰化溫度是影響Se吸光度的因素之一，過低的灰化溫度無法使基體完全灰化，導(dǎo)致背景吸光度升高；過高的灰化溫度會導(dǎo)致Se揮發(fā)損失，使Se的吸光度降低，重復(fù)性變差。試驗在固定其他參數(shù)條件下，只改變灰化溫度，測定Se的吸光度，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)灰化溫度＜1 100℃時，Se的吸光度隨著灰化溫度的增大而增大；當(dāng)灰化溫度≥1 100℃時，Se的吸光度開始下降。因此，試驗選擇最佳的灰化溫度為1 100℃。

2.3 原子化溫度的優(yōu)化

原子化溫度也是影響Se吸光度的因素之一，過低的原子化溫度無法使Se徹底原子化，導(dǎo)致其吸光度降低，吸附峰峰形變差；過高的原子化溫度會減少石墨管的使用次數(shù)。試驗在固定其他參數(shù)條件下，只改變原子化溫度，測定Se的吸光度，結(jié)果如圖3所示。不同原子化溫度條件下，Se的吸收峰峰形如圖4所示。

圖2 灰化溫度對吸光度的影響Fig.2 Effectof ashing temperatureon absorbancy

由圖3可知，當(dāng)原子化溫度＜2 200℃時，Se的吸光度隨著原子化溫度的增大而增大；當(dāng)原子化溫度≥2 200℃時，Se的吸光度趨于穩(wěn)定。由圖4可知，當(dāng)原子化溫度為2 000℃和2 100℃時，Se的吸收峰峰形較差，拖尾現(xiàn)象明顯；當(dāng)原子化溫度為2 200℃和2 300℃時，Se的吸收峰峰形較好，無明顯拖尾現(xiàn)象。因此，試驗選擇最佳的原子化溫度為2 200℃。

圖3 原子化溫度對吸光度的影響Fig.3 Effectof atom izing temperatureon absorbancy

圖4 原子化溫度對Se吸收峰的影響Fig.4 Effectof atom izing tem peratureon selenium absorption peak

2.4 標準工作曲線

通過ASpect CS軟件設(shè)置Se的檢測方法，將0.60mg/LSe 標準使用液、Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液、稀釋適當(dāng)倍數(shù)的空白溶液和待測樣品溶液放入MPE自動進樣器的對應(yīng)位置，建立相應(yīng)的測定序列，使用HR-CSGFAAS進行順序測定。以Se的質(zhì)量濃度為橫坐標、Se的吸光度為縱坐標，經(jīng)AS-pectCS軟件繪制非線性標準工作曲線如圖5所示。

圖5 標準工作曲線Fig.5 Standard working curves

所得方程為A=（0.037 312 5+0.917 625 5c）/（1+0.304 683 9c），相關(guān)系數(shù)為 0.999 2，表明在 0～0.6mg/L范圍內(nèi)，Se的質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的關(guān)系。

2.5 富硒蛹蟲草中有機硒的測定

在最佳試驗條件下測定總硒和無機硒的含量，根據(jù)“有機硒含量（mg/g）=總硒含量（mg/g）-無機硒含量（mg/g）”計算出富硒蛹蟲草中有機硒的含量，結(jié)果見表1。

表1 富硒蛹蟲草中有機硒的含量（n=3）Tab le1 The contentsof organic Se in selenium-enriched Cordycepsm ilitaris（n=3）

由表1可知，富硒蛹蟲草總硒含量為1.407mg/g，無機硒含量為0.083mg/g，計算出有機硒含量為1.324mg/g，所占百分比為94.1%，這說明富硒蛹蟲草含有豐富的有機硒，是補硒良品。

2.6 加標回收率試驗

將一定體積Se標準溶液和富硒蛹蟲草一起加入到燒杯或錐形瓶中，按1.3.4節(jié)進行操作，在最佳試驗條件下進行測定，計算Se的加標回收率[24-25]，結(jié)果見表2。

表2 加標回收率（n=3）Table2 Recoveriesof Se in selenium-enriched Cordycepsm ilitaris（n=3）

由表2可知，總硒和無機硒的加標回收率分別為95.7%和94.0%，相對標準偏差＜4.5%，表明參照DBS42/002-2014和GB 1903.21-2016測定富硒蛹蟲草總硒和無機硒，結(jié)果準確可靠，添加的Se標準溶液（無機硒）幾乎全部在待測無機硒試樣中。

3 結(jié)論

試驗以 Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液為基體改進劑，通過試驗優(yōu)化出基體改進劑最佳添加體積為5μL，最佳灰化溫度為1 100℃，最佳原子化溫度為2 200℃。測定結(jié)果表明，富硒蛹蟲草總硒含量為1.407mg/g，無機硒含量為0.083mg/g，計算出有機硒含量為1.324mg/g，所占百分比為94.1%，這說明富硒蛹蟲草含有豐富的有機硒，是補硒良品?？偽蜔o機硒的加標回收率分別為95.7%和94.0%，相對標準偏差＜4.5%，表明參照DBS42/002-2014和GB 1903.21-2016測定富硒蛹蟲草總硒和無機硒，結(jié)果準確可靠，添加的Se標準溶液（無機硒）幾乎全部在待測無機硒試樣中。

參考文獻：

[1]王明洋,方勇,裴斐,等.硒對杏鮑菇營養(yǎng)品質(zhì)和抗氧化酶活性的影響[J].食品科學(xué),2016,37(11):208-213

[2]Zhang Z,Zhao P,Guo J,et al.The extraction of different solubility protein in selenium enriched peanuts and the analysis of their antioxidantactivity[J].Science&Technology of Food Industry,2012,33(4):323-326

[3]BodnarM,Konieczka P.Evaluation of candidate referencematerial obtained from selenium-enriched sprouts for the purpose of selenium speciation analysis[J].LWT-Food Scienceand Technology,2016,70:286-295

[4]李紅衛(wèi),王開萍,吳娛,等.柱前衍生-反相高效液相色譜法研究富硒米曲霉中有機硒形態(tài)[J].食品科學(xué),2015,36(22):137-141

[5]Mao G H,Ren Y,Li Q,et al.Anti-tumor and immunomodulatory activity ofselenium (Se)-polysaccharide from Se-enriched Grifola frondosa[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,82(10):607-613

[6]Wang Y D,Wang X,Wong Y S.Generation of selenium-enriched ricewith enhanced grain yield,selenium contentand bioavailability through fertilisation with selenite[J].Food Chemistry,2013,141(3):2385-2393

[7]Bo Y,WangD,WeiG,etal.Selenium-enriched Candidautilis:Efficient preparation with l-methionine and antioxidant capacity in rats[J].Journal of Trace Elements in Medicine&Biology,2012,27(1):7-11

[8]Gionfriddo E,Naccarato A,Sindona G,etal.A reliable solid phase microextraction-gas chromatography-triple quadrupolemass spectrometry method for the assay of selenomethionine and selenomethylselenocysteine in aqueous extracts:Difference between selenized and not-enriched selenium potatoes[J].Analytica Chimica Acta,2012,747(20):58-66

[9]Mahn A,Zamorano M,Barrientos H,etal.Optimization of a process toobtain selenium-enriched freeze-dried broccoliwith high antioxidantproperties[J].LWT-Food Science and Technology,2012,47(2):267-273

[10]LIU LIHANG,FAN WANLUN.Incomplete digestion FAAS-faes determination ofcalcium,magnesium and potassium in human footexuviae[J].Physical Testing and Chemical Analysis PartB:Chemical Analysis,2005,37(2):348-352

[11]Dong JZ,Ding J,Yu PZ,etal.Composition and distribution of the main active components in selenium-enriched fruit bodies of Cordycepsmilitaris,link[J].Food Chemistry,2013,137(1/4):164-167

[12]Zhang B,Zhou K,Zhang J,etal.Accumulation and speciesdistribution ofselenium in Se-enriched bacterial cellsof the Bifidobacterium animalis01[J].Food Chemistry,2009,115(2):727-734

[13]王欣,幸苑娜,陳澤勇,等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測富硒食品中6種硒形態(tài)[J].分析化學(xué),2013,41(11):1669-1674

[14]楊洋,吳小勇,張湛,等.富硒靈芝發(fā)酵培養(yǎng)工藝及產(chǎn)物抗氧化能力研究[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26(12):1349-1353

[15]Peronico V CD,Raposo JL.Ultrasound-assisted extraction for the determination ofCu,Mn,Ca,and Mg in alternative oilseed cropsusing flame atomic absorption spectrometry[J].Food Chemistry,2016,196:1287-1292

[16]Ozbek N,Baysal A.A new approach for the determination ofsulphur in food samples by high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometer[J].Food Chemistry,2015,168(168):460-463

[17]Paz-Rodríguez B,Aboal-Somoza M,Bermejo-Barrera P.Application of High Resolution-Continuum Source Flame Atomic Absorption Spectrometry(HR-CSFAAS):Determination of traceelements in teaand tisanes[J].Food Chemistry,2015,170:492-500

[18]JSantos,M TOliva-Teles,CDelerue-Matos,etal.Multi-elemental analysis of ready-to-eat“baby leaf”vegetables usingmicrowave digestion and high-resolution continuum source atomic absorption spectrometry[J].Food Chemistry,2014,151(151):311-316

[19]Baysal A,Akman S.A practicalmethod for the determination ofsulphur in coal samples by high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometry[J].Talanta,2011,85(5):2662-2665

[20]Ozbek N,Akman S.Method development for the determination of fluorine in toothpaste viamolecular absorption of aluminum mono fluoride using a high-resolution continuum source nitrous oxide/acetylene flame atomic absorption spectrophotometer[J].Talanta,2012,94(6):246-250

[21]Brandao GC,Jesus RM D,Silva EG PD,etal.Use of slurry sampling for the direct determination of zinc in yogurt by high resolution-continuum source flameatomic absorption spectrometry[J].Talanta,2010,81(4/5):1357-1359

[22]秦杰,陳尚龍,張建萍,等.微波消解-原子吸收法測定雞精中金屬元素[J].食品研究與開發(fā),2014(22):63-67

[23]張建萍,陳尚龍,劉恩岐,等.微波消解-HR-CSAAS法測定幾種調(diào)味品中的微量元素[J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(6):1424-1427

[24]陳安徽,陳尚龍,巫永華,等.黃精酵素口服液中鈣、鐵和鋅的形態(tài)分析[J].現(xiàn)代食品科技,2016,32(1):1425-1427

[25]陳琛,蘇珂,陳貴堂,等.灰樹花中鐵的存在形態(tài)分析[J].食品科學(xué),2013,34(22):189-192