劉金光，李孝剛，王興祥

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連續(xù)施用有機(jī)肥對(duì)連作花生根際微生物種群和酶活性的影響①

劉金光1,3，李孝剛1，王興祥1,2*

(1 中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3 中國(guó)科學(xué)院紅壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)站，江西鷹潭 335211)

花生連作導(dǎo)致土傳病害易發(fā)，嚴(yán)重制約其產(chǎn)量和品質(zhì)。為探討持續(xù)施用有機(jī)肥緩解連作花生病害發(fā)生的防治機(jī)理，大田條件下研究了連續(xù)6年施用化肥、普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥(接種內(nèi)生菌擬莖點(diǎn)霉B3)后對(duì)連作花生根腐病、根際土壤典型微生物種群和酶活的影響。結(jié)果表明：與單施化肥相比，持續(xù)施用普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥可有效控制連作花生土傳病害發(fā)生，莢果產(chǎn)量提高23.8% 和47.9%。連續(xù)施用普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥均顯著提高根際過(guò)氧化氫酶、脫氫酶和酚氧化酶活性，熒光定量PCR進(jìn)一步測(cè)定出連續(xù)施用有機(jī)肥可顯著增加連作花生根際細(xì)菌和真菌的數(shù)量，說(shuō)明連續(xù)施用有機(jī)肥后連作花生根際微生物活性顯著提升。連續(xù)施用普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥顯著增加了連作花生根際有益微生物種群的數(shù)量，其中放線菌增加0.9倍和1.6倍，假單胞菌增加10.9倍和13.1倍，伯克氏菌增加2.6倍和1.9倍，芽孢桿菌增加1.1倍和2.1倍；然而連續(xù)施用有機(jī)肥對(duì)連作花生根際主要致病微生物種群(如鐮刀菌屬和青枯雷爾氏菌)無(wú)明顯影響。表明通過(guò)持續(xù)施用有機(jī)肥可有效提高連作花生根際有益微生物種群的數(shù)量和土壤酶活性，進(jìn)而改善連作花生根際微生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)連作土壤抑病能力，以達(dá)到控制連作花生土傳病害易發(fā)的目的。

花生連作；有機(jī)肥；有益微生物；土傳病害

花生是我國(guó)重要的油料作物，2014年全國(guó)種植面積為460.4萬(wàn)hm2，占油料作物種植面積的32.8%[1]。長(zhǎng)期連作導(dǎo)致花生病蟲(chóng)害加劇、產(chǎn)量逐年降低。輪作是克服連作障礙最經(jīng)濟(jì)有效的措施，可顯著提高產(chǎn)量[2-6]。然而，花生的經(jīng)濟(jì)效益較高，加之農(nóng)戶種植習(xí)慣不易改變，花生依然是紅壤旱地春夏主栽作物之一[2]。

土傳病害易發(fā)是限制連作花生持續(xù)高產(chǎn)的主要因素，而花生根際微生物群落失衡可能是其土傳病害易發(fā)的重要原因之一[7-8]。因而，通過(guò)調(diào)控土壤微生物區(qū)系以提升連作土壤抑病能力，是緩解連作下土傳病害易發(fā)的有效途徑。與長(zhǎng)期施用化肥相比，施用有機(jī)肥可提高土壤pH、微生物多樣性和活性[9]。利用拮抗性微生物與普通有機(jī)肥二次發(fā)酵得到的生物有機(jī)肥是目前研究的熱點(diǎn)，一方面增加拮抗微生物數(shù)量，抑制致病微生物的生長(zhǎng)；另一方面普通有機(jī)肥提高根際微生物活性、改善根際微生態(tài)，在防控土傳病害中取得良好效果，而關(guān)于利用其他植物有益微生物制備生物有機(jī)肥的研究報(bào)道得較少[10-13]。廣譜內(nèi)生真菌擬莖點(diǎn)霉()B3對(duì)致病微生物沒(méi)有明顯的拮抗作用，但可提高花生根際細(xì)菌、放線菌數(shù)量和土壤酶活性，改善植物生長(zhǎng)環(huán)境[14-15]。因此，本文通過(guò)分析連續(xù)施用化肥、普通有機(jī)肥和B3生物有機(jī)肥下連作花生根際微生物種群和土壤酶活性的效應(yīng)，探求連續(xù)施用有機(jī)肥緩解花生連作障礙的微生物機(jī)制，為開(kāi)發(fā)有效穩(wěn)定的花生連作障礙控制措施提供理論依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

定位實(shí)驗(yàn)地位于江西省鷹潭市余江縣劉家站(28°13′N(xiāo)，116°55′E)，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，1月平均氣溫5.9 ℃，7月平均氣溫30 ℃，年降水量1 750 mm。供試土壤為第四紀(jì)紅色黏土，其基礎(chǔ)理化性質(zhì)為：pH 5.0，有機(jī)質(zhì)15.4 g/kg，全氮0.9 g/kg，全磷0.7 g/kg，全鉀8.9 g/kg，有效磷23 mg/kg，速效鉀280 mg/kg。

1.2 有機(jī)肥制備

普通有機(jī)肥(OF)是經(jīng)過(guò)充分腐熟的豬糞堆肥；生物有機(jī)肥(BOF)為內(nèi)生真菌擬莖點(diǎn)霉()B3固體發(fā)酵物與普通有機(jī)肥1︰10比例充分混勻制備而成。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

定位試驗(yàn)始于2011年，試驗(yàn)布置之前該地已連續(xù)種植花生5 a。設(shè)3個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)：常規(guī)施肥(CK)，尿素300 kg/hm2、鈣鎂磷肥750 kg/hm2，KCl 225 kg/hm2，硼砂15 kg/hm2；處理OF和BOF分別施用普通有機(jī)肥OF、生物有機(jī)肥BOF，施用量為3 000 kg/hm2，硼砂15 kg/hm2，然后通過(guò)測(cè)定有機(jī)肥內(nèi)養(yǎng)分含量，補(bǔ)加相應(yīng)量的化肥，以保持有機(jī)肥處理與CK等量的氮、磷、鉀。每個(gè)小區(qū)10 m × 5 m。花生品種為贛花5號(hào)，每年4月播種，8月中旬收獲，常規(guī)田間管理，秋冬休閑。

1.4 樣品采集及測(cè)定項(xiàng)目

1.4.1 根際土采集和處理 2016年花生收獲前，小心拔起花生并去除根部大顆粒土塊，輕輕抖動(dòng)根部收集根際土，帶回實(shí)驗(yàn)室分成2份，分別4 ?C和–25 ?C保存，用于酶活性測(cè)定和微生物種群分析。

1.4.2 花生生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 每個(gè)小區(qū)采集3個(gè)1 m ×1 m樣方的花生植株，用于花生根瘤數(shù)和病情指數(shù)的測(cè)定，小區(qū)莢果實(shí)收、曬干至恒重后測(cè)定，折算成單位面積產(chǎn)量(kg/hm2)。根腐病是江西紅壤連作花生主要病害，其病情指數(shù)的評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0為無(wú)癥狀，1為主根發(fā)病面積占主根總面積的25% 以下，2為主根發(fā)病面積占主根總面積的25% ~ 50%，3為主根發(fā)病面積占主根總面積的50% ~ 75%，4為整個(gè)主根完全發(fā)病[16]。

1.4.3 土壤酶活性測(cè)定 土壤脫氫酶活性用碘硝基四唑紫(iodonitrotetrazolium chloride，INT)法測(cè)定[13]，OD464變化0.01為一個(gè)酶活單位；過(guò)氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法測(cè)定[14]，以20 min內(nèi)每克土壤分解過(guò)氧化氫的毫克數(shù)表示；酚氧化酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]，OD534變化0.01為一個(gè)酶活單位。

1.4.4 根際微生物數(shù)量測(cè)定 根際土壤微生物數(shù)量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)微生物特異性DNA片段的方法進(jìn)行測(cè)定，使用土壤DNA提取試劑盒(Fast DNA SPIN for Soil Kit，MP，美國(guó))根際土壤總DNA，所用引物及定量PCR條件見(jiàn)表1。將含有特異微生物DNA片段的重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，稀釋梯度6 ~ 8個(gè)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物及qPCR條件

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，并利用SPSS 16.0進(jìn)行不同處理之間數(shù)據(jù)顯著性分析。圖中不同字母的處理表示Duncan檢驗(yàn)差異顯著(＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 施用有機(jī)肥對(duì)連作花生根瘤數(shù)、莢果產(chǎn)量和根腐病病情指數(shù)的影響

常規(guī)單施化肥(CK)的花生植株矮小、根瘤少且小、結(jié)果數(shù)少，病情指數(shù)最高，達(dá)到75.2%(圖1)。與CK相比，連續(xù)施用普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥的花生根瘤數(shù)分別增加了160.3% 和252.9%，莢果產(chǎn)量分別提高23.8% 和47.9%，而根腐病病情指數(shù)顯著降低。

2.2 施用有機(jī)肥對(duì)花生根際土壤酶活性的影響

與CK相比，施用普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥均顯著提高了花生根際土壤過(guò)氧化氫酶、脫氫酶和酚氧化酶活性，施用普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥之間無(wú)顯著性差異(圖2)。

(CK為單施化肥處理；OF和BOF分別為施用有機(jī)肥OF和BOF，并保持與CK等量氮、磷、鉀。小寫(xiě)字母不同代表處理間差異達(dá)到P<0.05顯著水平，下同)

圖2 施用有機(jī)肥對(duì)連作花生根際土壤過(guò)氧化氫酶(A)、脫氫酶(B)和酚氧化酶(C)活性影響

2.3 施用有機(jī)肥對(duì)花生根際土壤主要微生物種群數(shù)量的影響

采用qPCR的技術(shù)手段分析了不同施肥條件下花生根際土壤主要微生物種群的數(shù)量。與CK相比，普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥處理土壤細(xì)菌數(shù)量分別提高74.2% 和132.7%，真菌分別提高44.4% 和44.7%(圖3)。施用普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥的花生根際土壤有益菌如放線菌、假單胞菌、伯克氏菌和芽孢桿菌的數(shù)量顯著高于對(duì)照處理：放線菌增加0.9倍和1.6倍，假單胞菌增加10.9倍和13.1倍，伯克氏菌增加2.6倍和1.9倍，芽孢桿菌增加1.1倍和2.1倍(圖4)?；ㄉH土壤致病微生物鐮刀菌和青枯雷爾氏菌的數(shù)量各處理之間無(wú)顯著差異(圖5)。與施用普通有機(jī)肥相比，施用生物有機(jī)肥增加細(xì)菌數(shù)量的幅度更大，尤其根際有益微生物類(lèi)群，如放線菌、假單胞菌和芽孢桿菌。

圖3 施用有機(jī)肥對(duì)連作花生根際細(xì)菌(A)和真菌(B)數(shù)量的影響

圖4 施用有機(jī)肥對(duì)連作花生根際土壤主要有益微生物數(shù)量的影響

圖5 施用有機(jī)肥對(duì)連作花生根際土壤鐮刀菌(A)和青枯雷爾氏菌(B)數(shù)量的影響

3 討論

化肥較有機(jī)肥肥效快，成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)最為普遍應(yīng)用的肥料。但近年來(lái)化肥用量不斷增加，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分比例失衡，花生根瘤減少，固氮能力減弱[2]；而土壤中有益微生物(如假單胞菌、伯克氏菌和根瘤菌)所占比例逐年降低，有害微生物(鐮刀菌、青枯雷爾氏菌)逐年增加[8, 27-28]。有機(jī)肥比化肥肥效慢，但長(zhǎng)期施用可提高土壤生物活性、改良土壤。張鵬等[13]在連作土壤中施用生物有機(jī)肥降低了番茄和辣椒青枯病的發(fā)病率，提高了產(chǎn)量。施用有機(jī)肥也可緩解連作條件下草莓、黃瓜和西瓜等枯萎病的發(fā)生[14, 29-31]。本研究連續(xù)6 a施用有機(jī)肥較常規(guī)施化肥的花生病情指數(shù)顯著降低，根瘤數(shù)量和莢果產(chǎn)量顯著提高(增產(chǎn)23.8%)?？缀昝鬧32]連續(xù)施豬糞有機(jī)肥13 a(1988—2001年)處理的紅壤旱地花生平均產(chǎn)量比單施化肥處理增產(chǎn)18.2%；Liu等[28]連續(xù)施用豬糞有機(jī)肥處理，第5年和第7年花生產(chǎn)量平均較長(zhǎng)期施用化肥處理增產(chǎn)34.8%(利用軟件Engauge Digitizer 6.0從圖表中提取數(shù)據(jù))，這表明施用豬糞有機(jī)肥可在一定程度上減輕花生連作障礙。本研究中生物有機(jī)肥比普通豬糞有機(jī)肥增產(chǎn)效果更顯著(增產(chǎn)47.9%)，表明利用內(nèi)生菌B3制備的生物有機(jī)肥可進(jìn)一步提高有機(jī)肥(腐熟豬糞)緩解花生連作障礙的效果。試驗(yàn)土壤及施肥條件下，養(yǎng)分元素一般不會(huì)影響花生生產(chǎn)，土壤pH也無(wú)顯著變化(數(shù)據(jù)未列)，土壤微生物區(qū)系的變化可能是施用有機(jī)肥緩解連作障礙的作用機(jī)制。

土壤一般屬于碳缺乏環(huán)境，而有機(jī)肥中含有大量的易分解碳和其他豐富的微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[33]，另外，有機(jī)肥中含有豐富的微生物類(lèi)群，因此持續(xù)施用有機(jī)肥具有提高生物活性和培肥土壤的作用。本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)施用普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥顯著提高了花生根際土壤脫氫酶和過(guò)氧化氫酶活性，表明土壤根際微生物活性提高[14,17]。qPCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)施用有機(jī)肥可顯著提高土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量，尤其有益微生物的數(shù)量，如放線菌、假單胞菌、伯克氏菌和芽孢桿菌。與施用普通有機(jī)肥相比，施用生物有機(jī)肥對(duì)根際有益微生物的促進(jìn)效果更好，這也與花生的產(chǎn)量結(jié)果相一致。根際微生物活性和生物量的提高，可增加與病原菌產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)和空間資源的競(jìng)爭(zhēng)，有利于阻止病原菌的侵入[12, 34]。因此，提高連作作物根際微生物活性可能是持續(xù)施用有機(jī)肥控制病害發(fā)生的重要作用機(jī)制。

根際有益微生物種群可提高植物獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的效率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制土傳病原微生物侵染。然而隨著連作年限增加，土壤中有益微生物逐漸減少而致病微生物不斷累積[8, 28, 35]。放線菌、伯克氏菌、假單胞菌和芽孢桿菌是農(nóng)田土壤中的典型有益微生物種群，含有大量植物促生功能菌、病原拮抗菌等，在土壤抑病過(guò)程中扮演重要角色[11, 36-38]。大量研究表明施用普通有機(jī)肥和生物有機(jī)肥均可顯著增加土壤中放線菌的數(shù)量，提高土壤抑病能力[13, 28-29]。此外，本研究中伯克氏菌、假單胞菌和芽孢桿菌的數(shù)量也顯著高于單施化肥處理。伯克氏菌和假單胞菌是植物根際主要微生物，與植物生長(zhǎng)關(guān)系密切[37]。隨著連作年限的增加，二者在花生土壤中的所占比例逐漸降低[27]。芽孢桿菌對(duì)長(zhǎng)期施用有機(jī)肥響應(yīng)敏感，隨著有機(jī)肥施用年限的增加，逐漸成為優(yōu)勢(shì)種，并可能與長(zhǎng)期施用有機(jī)肥作物的增產(chǎn)有關(guān)[39]。Wang等[11]利用含有W19的生物有機(jī)肥能夠有效抑制香蕉鐮刀萎蔫病的發(fā)病，并促進(jìn)其生長(zhǎng)。與長(zhǎng)期施用化肥相比，長(zhǎng)期施用有機(jī)肥的連作花生土壤具有更高水平的鏈霉菌、芽孢桿菌等有益微生物[28]。因此，持續(xù)施用有機(jī)肥下連作花生病情指數(shù)的降低和根瘤數(shù)量的增加與其根際有益微生物種群顯著增加有關(guān)。對(duì)此，通過(guò)持續(xù)施用有機(jī)肥可有效誘導(dǎo)有益微生物種群在連作土壤中定殖，進(jìn)而改善連作作物生長(zhǎng)，提升連作花生對(duì)病害菌的抑病能力。

根腐病和青枯病對(duì)花生生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p害，分別由鐮刀菌和青枯雷爾氏菌侵染引起。隨著連作年限的增加，鐮刀菌和青枯雷爾氏菌在土壤中逐漸累積，是連作土壤土傳病害高發(fā)的主要誘導(dǎo)因子[2, 8, 28]。酚酸是土壤中的主要化感物質(zhì)，可直接對(duì)植物生長(zhǎng)造成毒害，同時(shí)可促進(jìn)尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)、萎蔫酸的生成及提高致病相關(guān)水解酶活性，其在土壤中累積被認(rèn)為是導(dǎo)致土壤連作障礙的原因之一[20, 40-41]。酚氧化酶是土壤微生物轉(zhuǎn)化酚類(lèi)物質(zhì)的重要酶，本研究中施用有機(jī)肥提高了花生根際土壤酚氧化酶活性，有利于酚酸類(lèi)物質(zhì)的及時(shí)轉(zhuǎn)化?；贐iolog微平板法的微生物功能多樣性研究發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)肥(腐熟豬糞)有利于以酚酸類(lèi)物質(zhì)為碳源的微生物生長(zhǎng)[42]。本研究中，致病微生物在不同處理之間并無(wú)差異，但施用有機(jī)肥的花生病情指數(shù)顯著低于對(duì)照。因此，酚氧化酶活性的增加可能歸因于有機(jī)肥引起的伯克氏菌、假單胞菌和芽孢桿菌數(shù)量的增加，三者與鐮刀菌競(jìng)爭(zhēng)酚酸的利用[43-44]，降低酚酸對(duì)鐮刀菌的刺激作用。作物發(fā)病是植物、致病微生物和其他微生物種群相互影響、綜合作用的結(jié)果。因此，面對(duì)連作作物土傳病害高發(fā)的問(wèn)題，不能僅引入拮抗菌或者殺菌劑、強(qiáng)調(diào)抑制致病微生物，而應(yīng)從生態(tài)學(xué)的角度，培育有益微生物種群、調(diào)節(jié)土壤微生物環(huán)境，整體提升土壤抑病能力。

綜上所述，通過(guò)持續(xù)施用腐熟豬糞制成的有機(jī)肥可提高連作花生根際微生物活性，培育有益微生物種群在連作花生根際定殖，提升連作花生的根際抑病能力，以達(dá)到緩解連作花生土傳病害發(fā)生的目的。有機(jī)肥持續(xù)施用后誘導(dǎo)的有益微生物種群和微生物活性的增加是有效降低連作花生病害發(fā)生的更為普遍、穩(wěn)定的機(jī)制，所以持續(xù)施用有機(jī)肥是緩解連作障礙的長(zhǎng)效穩(wěn)定措施。

致謝：感謝南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院戴傳超教授提供擬莖點(diǎn)霉B3及其固體發(fā)酵物。

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Effects of Successive Application of Organic Fertilizers on Rhizosphere Microbial Populations and Enzyme Activities of Monoculture Peanut

LIU Jinguang1,3, LI Xiaogang1, WANG Xingxiang1,2*

(1 Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3 Experimental Station of Red Soil, Chinese Academy of Sciences, Yingtan, Jiangxi 335211, China)

Continuous peanut planting leads to the prevalence of soilborne diseases, and constitutes a serious constraint to the yield and quality. To investigate the biocontrol effects of organic fertilizers on suppressing the soilborne diseases and possible mechanisms, a 6 year field experiment was conducted to study the effects of successive application of chemical fertilizer, organic fertilizer and bioorganic fertilizer (organic fertilizer inoculated withB3) on the peanut root rot disease and on the abundance of group specific rhizosphere microbes and enzyme activities. Compared with the single application of chemical fertilizer, successive application of organic fertilizer and bioorganic fertiliaer could effectively control the soilborne diseases, and increased the peanut pod yields by 23.8% and 47.9%, respectively. organic fertilizer and bioorganic fertiliaer applications enhanced the activities of catalase, dehydrogenase and phenol oxidase in rhizosphere soil. The quantitative real-time PCR analysis further detected an increase of the bacterial and fungal abundance, indicating an increase in the soil microbial activities. organic fertilizer and bioorganic fertiliaer applications also promoted the growth of the beneficial rhizosphere microorganisms, includingincreased 0.9-and 1.6–fold,increased 10.9-and 13.1–fold,increased 2.6-and 1.9–fold, andincreased 1.1-and 2.1–fold, respectively. However, no significant difference was observed on the abundance of major pathogenic microorganisms, such asand, two notorious pathogenic microorganisms of peanut between treatments. The above results indicated that successive application of organic fertilizers, especially bioorganic fertiliaer, can control the prevalence of soilborne diseases by increasing the number of beneficial rhizosphere microorganisms and manipulating the soil microbiome to increase soil health.

Continuous peanut production; Organic fertilizer; Beneficial microorganism; Soilborne diseases

10.13758/j.cnki.tr.2018.02.012

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41671306, 41371290)資助。

(xxwang@issas.ac.cn)

劉金光(1987—)，男，河南周口人，博士研究生，主要從事土壤微生物生態(tài)方面研究。E-mail: ljg.1987@163.com

S144.2；S154.3

A