應(yīng) 櫻

浙江省嘉興市第一醫(yī)院呼吸科，浙江嘉興 314000

目前，抗生素耐藥已經(jīng)成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題，臨床治療感染性疾病的新方向變?yōu)閷?nèi)源性天然抗生素抗菌肽LL-37表達(dá)增加，促進(jìn)宿主免疫防御功能的提升[1-3]。為了將有效的理論依據(jù)提供給臨床對(duì)抗生素的科學(xué)合理應(yīng)用，對(duì)感染性疾病進(jìn)行積極有效的治療，從而對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行切實(shí)有效的改善，本文研究SIRT1對(duì)肺炎鏈球菌感染肺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)LL-37表達(dá)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間為2016年11月～2017年10月，采用中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)提供的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549（A549細(xì)胞）、人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B細(xì)胞），美國(guó)模式肺炎鏈球菌（SP）作為細(xì)胞菌株，培養(yǎng)物集存庫(kù) （ATCC）為6303。美國(guó)GIBCO公司生產(chǎn)的RPMI1640培養(yǎng)基、杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)的胎牛血清、美國(guó)OXOID公司生產(chǎn)的哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)等，美國(guó)Forma公司生產(chǎn)的二級(jí)生物安全柜，美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)的超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，在此過程中將不含雙抗RPMI1640培養(yǎng)液充分利用起來，以（3～4）×105/mL密度在6孔板中接種A549細(xì)胞，待細(xì)胞向30%～50%滿皿底面積生長(zhǎng)時(shí)分為對(duì)照組、si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組、陰性對(duì)照 siRNA（siRNA-NC）組、lipo組五組。其中對(duì)照組不將其他試劑加入培養(yǎng)基；si-SIRT1序列①組將轉(zhuǎn)染si-SIRT1序列①加入培養(yǎng)基；si-SIRT1序列②組將轉(zhuǎn)染si-SIRT1序列②加入培養(yǎng)基；陰性對(duì)照siRNA（siRNA-NC）組將轉(zhuǎn)染不匹配人的任何基因的siRNA（轉(zhuǎn)染無意義siRNA）加入培養(yǎng)基，將其作為對(duì)照，以將本實(shí)驗(yàn)受到siRNA及轉(zhuǎn)染操作的影響排除；lipo組將lipofectaminTM2000試劑加入培養(yǎng)基，以將本實(shí)驗(yàn)受到脂質(zhì)體的影響排除。上海吉馬公司設(shè)計(jì)合成SIRT1 siRNA序列，具體見表1。由于細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA中涉及RNA，因此去酶處理實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用EP管及槍頭等實(shí)驗(yàn)器材，從而有效避免Rnase降解的現(xiàn)象。采用qRT-PCR對(duì)A549細(xì)胞的SIRT1沉默效果進(jìn)行檢測(cè)，并采用Western Blot對(duì)A549細(xì)胞的SIRT1沉默效果進(jìn)行檢測(cè)[4-10]。

表1 SIRT1 siRNA序列[4]

1.3 觀察指標(biāo)

培養(yǎng)瓶或6孔板中的BEAS-2B及A549細(xì)胞向30%～50%左右滿皿底面積生長(zhǎng)時(shí)分別進(jìn)行3 d的細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理，在此過程中嚴(yán)格依據(jù)組別，SIRT1激動(dòng)劑（SRT1720）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，將新鮮無雙抗培養(yǎng)液加入其中孵育。將MOI：20的SP菌懸液加入到各孔中，對(duì)照組除外，進(jìn)行6 h的感染后將感染終止。將PBS預(yù)處理細(xì)胞設(shè)定為對(duì)照組，將SPS感染設(shè)定為SP組，將SP感染+75 nmol/L si-SIRT1序列②轉(zhuǎn)染3 d設(shè)定為si-SIRT1+SP組，將SP感染+25 μmol/L的SRT1720預(yù)賦予1 d設(shè)定為SRT1720+SP組，將SP感染+25 μmol/L DMSO預(yù)孵育 1 d設(shè)定為 DMSO+SP組，各組均進(jìn)行3次重復(fù)。采用LDH細(xì)胞毒性試驗(yàn)對(duì)各組細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，采用qRT-PCR對(duì)BEAS-2B及A549細(xì)胞SIRT1及LL-37 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，采用ELISA對(duì)BEAS-2B及A549細(xì)胞上清液LL-37濃度進(jìn)行檢測(cè)[11-18]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，qRT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞的SIRT1沉默效果、Western Blot檢測(cè)A549細(xì)胞的SIRT1沉默效果、五組對(duì)BEAS-2B及A549細(xì)胞毒性活力的影響、SIRT1對(duì) SP誘導(dǎo) BEAS-2B及A549細(xì)胞表達(dá)LL-37 mRNA的影響等計(jì)量資料用（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞的SIRT1沉默效果

si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組的SIRT1 mRNA均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），而si-SIRT1序列②組的SIRT1 mRNA又顯著低于si-SIRT1序列①組（P<0.05），見表 2。

表2 qRT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞的SIRT1沉默效果（±s）

表2 qRT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞的SIRT1沉默效果（±s）

注：與si-SIRT1序列①組比較，#P<0.05；與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別 獨(dú)立試驗(yàn)次數(shù) SIRT1 mRNA對(duì)照組si-SIRT1序列①組si-SIRT1序列②組siRNA-NC組lipo組F值P 33333 1.05±0.11 0.70±0.12*0.15±0.04#*0.93±0.10 1.12±0.10 42.660<0.05

2.2 Western Blot檢測(cè)A549細(xì)胞的SIRT1沉默效果

si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組的SIRT1/β-actin均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），lipo組的SIRT1/β-actin顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但 siRNA-NC組和對(duì)照組的SIRT1/β-actin之間的差異不顯著 （P>0.05），si-SIRT1 序 列 ① 組 、si-SIRT1 序 列 ② 組 的SIRT1/β-actin 之間的差異也不顯著（P>0.05），見表3。

2.3 五組對(duì)BEAS-2B及A549細(xì)胞毒性活力的影響比較

SP組、si-SIRT1+SP組的BEAS-2B及A549細(xì)胞毒性均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而si-SIRT1+SP組的BEAS-2B及A549細(xì)胞毒性又均顯著高于SP組（P<0.05），見表 4。

表3 Western Blot檢測(cè)A549細(xì)胞的SIRT1沉默效果（±s）

表3 Western Blot檢測(cè)A549細(xì)胞的SIRT1沉默效果（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別 獨(dú)立試驗(yàn)次數(shù) SIRT1/β-actin對(duì)照組si-SIRT1序列①組si-SIRT1序列②組siRNA-NC組lipo組F值P 33333 0.23±0.01 0.14±0.01*0.11±0.01*0.20±0.01 0.40±0.03*72.530<0.05

表4 五組對(duì)BEAS-2B及A549細(xì)胞毒性活力的影響比較（±s，%）

表4 五組對(duì)BEAS-2B及A549細(xì)胞毒性活力的影響比較（±s，%）

注：與SP組比較，*P<0.05

組別 獨(dú)立試驗(yàn)次數(shù) BEAS-2B細(xì)胞毒性 A549細(xì)胞毒性對(duì)照組SP組si-SIRT1+SP組SRT1720+SP組DMSO+SP組F值P 33333 0.35±0.07*7.74±1.65 19.60±1.86*8.51±0.80 8.34±1.51 98.261<0.05 0.20±0.03*4.42±0.40 15.26±1.63*4.85±0.25 4.67±0.38 152.920<0.05

2.4 SIRT1對(duì)SP誘導(dǎo)BEAS-2B及A549細(xì)胞表達(dá)LL-37 mRNA的影響

2.4.1 SIRT1對(duì)SP誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞表達(dá)LL-37mRNA的影響 BEAS-2B細(xì)胞方面，si-SIRT1+SP組的SIRT1 mRNA 顯著低于 SP 組（P<0.05），LL-37 mRNA顯著高于SP組（P<0.05）；SRT1720+SP組的SIRT1 mRNA顯著高于SP組（P<0.05），LL-37 mRNA顯著低于SP 組（P<0.05）。 SP 組、SRT1720+SP 組、DMSO+SP 組的 SIRT1 mRNA均顯著高于對(duì)照組 （P<0.05），si-SIRT1+SP組的SIRT1 mRNA顯著低于對(duì)照組 （P<0.05）；SP 組、si-SIRT1+SP 組的 LL-37 mRNA均顯著高于對(duì)照組 （P<0.05），SRT1720+SP組的LL-37 mRNA顯著低于對(duì)照組（P<0.05），但DMSO+SP組和對(duì)照組的LL-37 mRNA之間的差異不顯著（P>0.05），見表5。

表5 SIRT1對(duì)SP誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞表達(dá)LL-37mRNA的影響（±s）

表5 SIRT1對(duì)SP誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞表達(dá)LL-37mRNA的影響（±s）

注：與SP組比較，#P<0.05；與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別 獨(dú)立試驗(yàn)次數(shù) SIRT1 mRNA LL-37 mRNA對(duì)照組SP組si-SIRT1+SP組SRT1720+SP組DMSO+SP組F值P 55555 1.04±0.11 3.05±0.42*0.20±0.05#*8.54±0.55#*2.95±0.32*420.445<0.05 1.07±0.17 3.88±0.35*12.78±2.32#*0.43±0.04#*2.87±0.54 105.930<0.05

2.4.2 SIRT1對(duì)SP誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)LL-37 mR-

NA的影響 A549細(xì)胞方面，si-SIRT1+SP組的SIRT1mRNA顯著低于SP組（P<0.05），LL-37 mRNA顯著高于SP 組（P<0.05）；SRT1720+SP 組的SIRT1 mRNA 顯著高于 SP組（P<0.05），LL-37 mRNA 顯著低于 SP組（P<0.05）。SP組、SRT1720+SP組、DMSO+SP組的 SIRT1 mRNA均顯著高于對(duì)照組 （P<0.05），si-SIRT1+SP組的 SIRT1 mRNA 顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；SP組、si-SIRT1+SP組的LL-37 mRNA均顯著高于對(duì)照組 （P<0.05），SRT1720+SP組的LL-37 mRNA顯著低于對(duì)照組（P<0.05），但DMSO+SP組和對(duì)照組的LL-37 mRNA之間差異不顯著（P>0.05），見表6。

表6 SIRT1對(duì)SP誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)LL-37 mRNA的影響（±s）

表6 SIRT1對(duì)SP誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)LL-37 mRNA的影響（±s）

注：與SP組比較，#P<0.05；與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別 獨(dú)立試驗(yàn)次數(shù) SIRT1 mRNA LL-37 mRNA對(duì)照組SP組si-SIRT1+SP組SRT1720+SP組DMSO+SP組F值P 55555 1.04±0.11 2.65±0.45*0.13±0.02#*5.54±0.44#*2.35±0.30*198.556<0.05 1.05±0.15 2.30±0.30*5.18±1.00#*0.47±0.08#*1.65±0.31 67.530<0.05

3 討論

SIRT1的生物學(xué)作用廣泛，能夠?qū)AD+依賴性蛋白進(jìn)行催化，促進(jìn)其乙?；陌l(fā)生，在轉(zhuǎn)錄、代謝過程中作為調(diào)節(jié)因子發(fā)揮極為重要的作用[19-21]。LL-37受外源性微生物成分和內(nèi)源性信號(hào)分子刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜多樣，彼此存在交叉對(duì)話，且存在細(xì)胞種類和微環(huán)境刺激特異性。在細(xì)胞非應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，l，25-二羥基維生素 D3[1，25-dihydroxyvitamin D3，l，25（OH）2D3]，在多種調(diào)控 LL-37 表達(dá)因子中起樞紐作用，多種物質(zhì)可經(jīng)維生素D3依賴機(jī)制放大其誘導(dǎo)效應(yīng)。細(xì)胞因子可通過維生素D3介導(dǎo)或其他作用機(jī)制放大其誘導(dǎo)LL-37表達(dá)效應(yīng)。在外界干擾觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，NF-κB．C/EBPa通路在表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞分化狀態(tài)亦參與LL-37的表達(dá)調(diào)控。最近應(yīng)用無標(biāo)記質(zhì)譜定量分析的生物信息學(xué)軟件又發(fā)現(xiàn)TR/RXR激活、類花生酸信號(hào)和類固醇生物合成這三種新型信號(hào)通路參與LL-37的表達(dá)調(diào)節(jié)。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[22-25]，SP對(duì)BEAS-2B細(xì)胞活性造成損傷的方式為MOI與感染時(shí)間依賴性，SP感染BEAS-2B及A549細(xì)胞能夠?qū)L-37表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)，在機(jī)體免疫防御反應(yīng)中參與。與A549細(xì)胞相比，BEAS-2B細(xì)胞SP（MOI20）感染6 h及未感染狀態(tài)下均具有顯著較高的LL-37蛋白表達(dá)，以此認(rèn)為L(zhǎng)L-37表達(dá)可能具有細(xì)胞特異性。SP感染時(shí)，在BEAS-2B及A549細(xì)胞LL-37表達(dá)中，SIRT1均發(fā)揮著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果表明，si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組的SIRT1 mRNA均顯著低于對(duì)照組 （P<0.05），而si-SIRT1序列②組的SIRT1 mRNA又顯著低于si-SIRT1序列①組 （P<0.05）；si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組的SIRT1/β-actin均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），lipo 組的 SIRT1/β-actin 顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但 siRNA-NC 組和對(duì)照組的 SIRT1/βactin之間的差異不顯著 （P>0.05），si-SIRT1序列①組、si-SIRT1序列②組的SIRT1/β-actin之間的差異也不顯著 （P>0.05）；SP組、si-SIRT1+SP組的 BEAS-2B及A549細(xì)胞毒性均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而si-SIRT1+SP組的BEAS-2B及A549細(xì)胞毒性又均顯著高于SP組 （P<0.05）；BEAS-2B細(xì)胞及A549細(xì)胞方面，si-SIRT1+SP組的SIRT1 mRNA顯著低于SP組（P<0.05），LL-37 mRNA 顯著高于 SP 組（P<0.05）；SRT1720+SP組的SIRT1 mRNA顯著高于SP組 （P<0.05），LL-37 mRNA 顯著低于 SP 組（P<0.05）。SP 組、SRT1720+SP組、DMSO+SP組的SIRT1 mRNA均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），si-SIRT1+SP組的SIRT1 mRNA顯著低于對(duì)照組 （P<0.05）；SP組、si-SIRT1+SP組的LL-37 mRNA均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），SRT1720+SP組的LL-37 mRNA顯著低于對(duì)照組 （P<0.05），但DMSO+SP組和對(duì)照組的LL-37 mRNA之間的差異不顯著（P>0.05），和上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致。

總之，SIRT1對(duì)肺炎鏈球菌感染肺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)LL-37表達(dá)起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，值得臨床充分重視。

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